氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合偏最小二乘法在生鮮牛、鴨混合肉含量判別分析中的應(yīng)用

魏泉增　楊自翔　肖付剛

摘 要：采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase micro extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)提取和分析生鮮牛、鴨混合肉中的揮發(fā)性化合物，利用偏最小二乘（partial least squares，PLS）法對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，對(duì)不同比例生鮮牛、鴨混合肉進(jìn)行判別分析。結(jié)果表明：生鮮牛、鴨混合肉中共鑒定出39 種揮發(fā)性化合物;PLS模型可以有效區(qū)分不同比例生鮮牛、鴨混合肉，利用訓(xùn)練集和驗(yàn)證集數(shù)據(jù)驗(yàn)證模型，評(píng)估均方差為3.455 9，預(yù)測(cè)均方差為4.068 9，PLS模型對(duì)不同比例生鮮牛、鴨混合肉的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較高。本方法在判別不同比例生鮮牛、鴨混合肉方面準(zhǔn)確性較高。

關(guān)鍵詞：生鮮牛、鴨混合肉;偏最小二乘法;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

Abstract： The volatile compounds of beef adulterated with duck meat in different proportions were analyzed by headspace solid-phase micro extraction （HS-SPME） coupled to gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results showed that a total of 39 volatile compounds were identified in the two meats. The GC-MS data were analyzed by partial least squares （PLS） method. The pattern recognition analysis by PLS showed clear separation of the meat mixtures by internal and external validations. The obtained values for root mean square error of estimation （RMSEE， 3.455 9） and root mean square error of prediction （RMSEP， 4.068 9） showed the PLS model had strong predictive ability. The method provided a highly accurate prediction model for distinguishing different levels of duck in adulterated beef.

Keywords： duck adulteration in beef; partial least squares; gas chromatography-mass spectrometry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200210-032

中圖分類號(hào)：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）05-0053-06

牛肉美味可口，鮮嫩多汁，含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、B族維生素以及多種礦物質(zhì)。由于牛肉價(jià)格昂貴，火鍋生鮮肉中的摻假現(xiàn)象頻發(fā)，并且以摻假羊肉、牛肉居多。大多數(shù)用于摻假的肉類以豬肉和鴨肉為主。目前，肉類摻假的檢測(cè)方法日漸成熟。例如采用單克隆抗體、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)檢測(cè)熟制紅肉（豬肉、牛肉、羊肉、鹿肉、馬肉）中是否添加熟制禽肉（雞肉和火雞肉）[1];運(yùn)用豬肉、牛肉、羊肉和馬肉中的肽段作為生物標(biāo)記物檢測(cè)肉中是否摻假[2];運(yùn)用電子舌技術(shù)區(qū)分牛肉、綿羊肉和山羊肉[3]。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)、DNA生物標(biāo)簽擴(kuò)增、紅外光譜[4-5]、電子鼻分析[6]、核磁共振[7]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]等技術(shù)也被用于檢測(cè)肉類摻假。采用GC-MS技術(shù)進(jìn)行定量分析具有簡(jiǎn)便、靈敏度高和定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)的GC-MS樣品前處理技術(shù)有頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro extraction，HS-SPME）、同時(shí)蒸餾萃取、有機(jī)溶劑萃取、超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾等方法。孫建軍等[9]采用GC-MS技術(shù)鑒定牛肉香氣成分。但是GC-MS技術(shù)所獲得的數(shù)據(jù)較多，且數(shù)據(jù)間相關(guān)性較高，處理較為復(fù)雜繁瑣。偏最小二乘（partial least squares，PLS）法是一種新型多元統(tǒng)計(jì)分析法，是多元線性回歸法、主成分分析法和典型相關(guān)分析法的有機(jī)結(jié)合[10]。PLS法可以有效地解決樣本量少、自變量多、相關(guān)性高的數(shù)據(jù)模型，近年來(lái)在食藥分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-14]。

一般地，肉類摻假檢測(cè)方法多采用特異性標(biāo)記物、特征波長(zhǎng)或擴(kuò)增DNA靶點(diǎn)，并且存在操作復(fù)雜、精確度不高等問(wèn)題。目前關(guān)于定量分析生鮮牛、鴨混合肉含量的研究較少。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析不同比例生鮮牛、鴨混合肉中的香氣成分，利用PLS法建模，建立生鮮牛、鴨混合肉的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮牛肉（牛肩肉）、鴨肉（鴨脯肉） 本地超市。

C8～C40正構(gòu)烷烴（色譜純） 北京百靈威科技有限公司、氦氣（純度99.999%） 河南迎眾化工產(chǎn)品有限公司;純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C GC-MS儀 美國(guó)安捷倫公司;65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯固相微萃取頭和萃取手柄? ?青島貞正分析儀器有限公司;ML204分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將牛肉和鴨肉分別制成肉糜，使用保鮮膜封裝并作標(biāo)記，置于-20 ℃冰箱冷凍待用，并于48 h內(nèi)進(jìn)行分析。將鴨肉分別以0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%比例替代牛肉，制備不同比例的生鮮牛、鴨混合肉進(jìn)行GC-MS分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5 次。

1.3.2 GC-MS分析

取1.00 g肉糜（生鮮牛、鴨混合肉）。加入2 mL去離子水，置于15 mL頂空瓶中，90 ℃水浴15 min，HS-SPME吸附40 min，250 ℃下解吸3 min。

GC條件：DB-WAX柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）;載氣：氦氣;恒流柱流速1.2 mL/min;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，5 ℃/min至155 ℃，2 ℃/min至170 ℃，5 ℃/min至250 ℃。

MS條件：電子轟擊離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;溶劑延遲5.5 min;掃描模式Scan;掃描質(zhì)量范圍29～700 u。

1.3.3 不同比例生鮮牛、鴨混合肉樣品的定性分析

利用GC-MS儀器自帶的NIST14譜庫(kù)對(duì)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，以匹配度>600作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，按

1.4 數(shù)據(jù)處理

設(shè)定生鮮牛、鴨混合肉含量為因變量，以香氣物質(zhì)的相對(duì)峰面積為自變量，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PLS分析及相關(guān)圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉與鴨肉香氣成分的對(duì)比分析

由圖1～2可知，鴨肉和牛肉的香氣成分總離子流圖差異明顯，牛肉和鴨肉中苯肟類化合物的相對(duì)含量最高，其次是醛類和烴類化合物，其余物質(zhì)相對(duì)含量較小，且差別不大。

由表1可知，生鮮牛、鴨混合肉中共檢測(cè)出39 種揮發(fā)性化合物。除了苯甲酸乙酯、環(huán)己烯、反-2-庚烯醛、順-4-（羥甲基）環(huán)己烷羧酸以外，其他揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量均隨著牛肉含量的增加而增加。在鴨肉中檢出的

2，4-壬二烯、2-癸烯醛、鄰苯二甲酸二丁酯、4-（1-甲基-丙基）苯酚，也在牛肉中檢測(cè)到。研究表明苯三甲基丁醛是鴨肉中的主要化合物[15]，但在本研究中均未檢出。

醛類化合物在酯類物質(zhì)氧化過(guò)程中形成，是構(gòu)成牛肉香氣成分重要的化合物種類之一。2，4-癸二烯醛是亞油酸的氧化產(chǎn)物，所測(cè)樣品中2，4-癸二烯醛相對(duì)含量較多。己醛來(lái)源于ω-6多不飽和脂肪酸的氧化，具有極低的香氣閾值和腐臭味。不同季節(jié)牛肉的香氣成分含量明顯不同，冬春季牛肉的香氣成分含量較高，但是丙醇、3-甲基正丁醛、2-丁醇、庚烷、己醇、甲基異丙基苯和壬醛含量沒(méi)有顯著差異[16-17]。

烴類化合物主要來(lái)源于脂肪酸降解或動(dòng)物體內(nèi)的脂肪氧化[18]。正烷烴可能來(lái)自支鏈脂肪酸的氧化，短鏈烷烴是脂肪自動(dòng)氧化的次級(jí)產(chǎn)物，而脂肪的自動(dòng)氧化還伴隨著醇、醛、酮類物質(zhì)的產(chǎn)生[19]。

酯類化合物具有水果香氣[20]，主要來(lái)源于肉中醇類和羧酸類化合物發(fā)生的酯化反應(yīng)，對(duì)于肉類香氣的貢獻(xiàn)不大。本實(shí)驗(yàn)牛肉和鴨肉中均檢出酯類化合物，相對(duì)含量均較低且差異不明顯。

醇類和酸類化合物在肉類中含量較低。陳海濤等[21]通過(guò)SPME法僅在醬牛肉中檢測(cè)到2 種酸類化合物。醇類物質(zhì)產(chǎn)生可能和微生物代謝葡萄糖和氨基酸或油脂氧化有關(guān)[22-23]。雖然3-甲基-1-丁醇經(jīng)常在生肉中檢測(cè)到[24]，但本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到，可能是由于吸附溫度較高引起的。

呋喃類化合物和含硫化合物等雜環(huán)化合物對(duì)肉類的香氣貢獻(xiàn)較大，呋喃類化合物主要呈現(xiàn)甜香、烤香、焦香等香氣，呋喃主要形成途徑是酮基二元酸通過(guò)加熱后的二次羧酸轉(zhuǎn)換脫羧形成[25]。含硫化合物可能來(lái)源于還原糖與含硫氨基酸之間的美拉德反應(yīng)，也可能來(lái)源于含硫氨基酸的降解[26-27]。醚類化合物主要為茴香醚。

2.2 不同比例生鮮牛、鴨混合肉樣品的PLS分析

采用SIMCA-P軟件中留一法對(duì)全樣本進(jìn)行PLS回歸分析[28-30]。通過(guò)PLS回歸模型提取3 個(gè)主成分：第1主成分分別解釋了原自變量系統(tǒng)和因變量系統(tǒng)48.7%、85.8%的變異信息;第2主成分分別解釋了原自變量系統(tǒng)和因變量系統(tǒng)中13.6%、11.9%的變異信息;第3主成分分別解釋了原自變量系統(tǒng)和因變量系統(tǒng)中9.73%、1.13%的變異信息。前3 個(gè)主成分能夠解釋因變量系統(tǒng)中72.0%的變異信息，對(duì)自變量的信息利用率為98.9%，而前3 個(gè)主成分所預(yù)測(cè)模型的累計(jì)差異為98.4%。這說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)精度良好。

由圖3可知，所建立的PLS模型能夠?qū)⒉煌壤膿郊倥Ｈ鈪^(qū)分開(kāi)。所有樣本均在95%的置信區(qū)間內(nèi)，無(wú)異常值。

由表2可知，不同比例生鮮牛、鴨混合肉預(yù)測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且與真實(shí)值接近，二者之間的相關(guān)系數(shù)為0.997 8，建模后預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間的誤差均在10%以內(nèi)。這表明PLS模型在預(yù)測(cè)不同比例生鮮牛、鴨混合肉中牛肉含量具有較高的精度。

以訓(xùn)練集真實(shí)值為縱坐標(biāo)、預(yù)測(cè)值為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。由圖4～5可知，不同比例生鮮牛、鴨混合肉被明顯分開(kāi)。以評(píng)估均方差（root mean square error of estimation，RMSEE）評(píng)價(jià)真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的差異[30]，得到訓(xùn)練集RMSEE為3.455 9，表明預(yù)測(cè)值能較好反映真實(shí)值。經(jīng)驗(yàn)證集驗(yàn)證，預(yù)測(cè)均方差（root-mean-square error of prediction，RMSEP）為4.068 9，與RMSEE差值較小，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)效果較好。

采用排列檢驗(yàn)圖判斷PLS模型是否存在過(guò)擬合現(xiàn)象。Y-觀測(cè)值（牛肉含量）的順序隨機(jī)排列，而X-矩陣（生鮮牛、鴨混合肉揮發(fā)性成分）是完整的。隨機(jī)選定某個(gè)變量，以排列后變量向量和原始變量向量之間的相關(guān)系數(shù)為橫軸，擬合優(yōu)度（R2）與預(yù)測(cè)優(yōu)度（Q2）為縱軸，比較訓(xùn)練集模型的R2與Q2。由圖6可知，R2均大于Q2，且R2與Q2回歸線在縱軸的截距分別為0.201和-0.399。一般認(rèn)為R2與Q2的回歸線在縱軸的截距分別小于0.40、0.05，表示模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

采用HS-SPME技術(shù)對(duì)不同比例生鮮牛、鴨混合肉的香氣成分進(jìn)行提取，采用GC-MS結(jié)合RI進(jìn)行分析，牛肉和鴨肉中共鑒定出39 種化合物。采用PLS法對(duì)不同比例生鮮牛、鴨混合肉進(jìn)行判別分析，并建立預(yù)測(cè)模型，得到模型RMSEE為3.455 9、RMSEP為4.068 94，表明模型的預(yù)測(cè)精度較高。R2與Q2分析結(jié)果表明，該模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的比較結(jié)果表明，PLS模型具有較好地預(yù)測(cè)能力，并能夠較好判斷生鮮牛、鴨混合肉中的牛肉含量。本方法為肉類產(chǎn)品的質(zhì)量控制、判別摻假肉方面提供了新的途徑和思路。

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