廣域照射拉曼光譜技術(shù)結(jié)合簇類獨立軟模式法快速鑒別原料肉及摻假肉

徐記各　韓瑩　忻欣　史喜菊

摘 要：應用廣域照射（wide area illumination，WAI）拉曼光譜技術(shù)與簇類獨立軟模式（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）法，結(jié)合多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）和光譜儀降噪和波長標定（spectrometer noise reduction and wavelength calibration，SNRWC）降噪技術(shù)，建立鴨、羊、豬3 種原料肉及摻假羊肉的定性識別模型。結(jié)果表明：經(jīng)MSC與SNRWC處理后，鴨、羊、豬3 種原料肉之間及羊肉、摻假羊肉之間的主成分分析結(jié)果具有明顯的聚類趨勢，在此基礎(chǔ)上建立SIMCA定性分類模型，對不同產(chǎn)地的37 個原料肉樣品種屬進行定性鑒別，識別正確率達100%;對4 個摻假羊肉和5 個未摻假羊肉樣品識別正確率也為100%。因此，拉曼光譜分析技術(shù)結(jié)合有效的數(shù)據(jù)前處理方法及化學計量學方法可對鴨、羊、豬原料肉種屬及摻假羊肉進行鑒別。與常規(guī)方法相比，該檢測過程快速、方便，并且無需樣品前處理。

關(guān)鍵詞：廣域照射;拉曼光譜;原料肉;快速鑒別;簇類獨立軟模式方法;主成分分析

Abstract： Qualitative recognition models were established by using wide area illumination （WAI） Raman scheme and soft independent modeling of class analogy （SIMCA） for rapid identification of duck， lamb， pork and adulterated meat. The spectra of all samples were pre-processed by multiplicative scatter correction （MSC） and spectrometer noise reduction and wavelength calibration （SNRWC） method and then principal component analysis was implemented to observe the clustering trend. It turned out that most of the duck， lamb and pork samples as well as most of the lamb samples and adulterations were well separated. Finally， the qualitative classification models were established by using SIMCA. All validation samples were identified by the SIMCA model with an accuracy of 100%， including 37 meat samples from different species and geographical origins， as well as four adulterated and five unadulterated lamb samples. Therefore， the WAI Raman scheme coupled with chemometrics could distinguish among lamp， duck， and pork and adulterated lamb， and it proved to be more fast， convenient， without the need for any sample pretreatment compared with the routine method.

Keywords： wide area illumination; Raman spectroscopy; raw meat; rapid discrimination; soft independent modeling of class analogy; principal component analysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191211-303

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）05-0070-06

動物源性食品是人類飲食結(jié)構(gòu)中的重要組成部分。肉類的營養(yǎng)價值、風味以及消費者習慣等的不同導致其價格差異較大，并且利益驅(qū)使導致市場上肉類摻假現(xiàn)象持續(xù)存在。據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2015年起豬肉在飲食中的比重大幅下降，牛、羊肉的比重持續(xù)增長。這反映了人們的飲食結(jié)構(gòu)由低價豬肉消費轉(zhuǎn)變?yōu)楦邇r牛、羊肉消費，導致市場上出現(xiàn)了以相對廉價的鴨肉冒充牛、羊肉的亂象。這不僅擾亂了正常的市場競爭秩序，還嚴重損害了消費者的利益。因此，開發(fā)肉類種屬及摻假的快速鑒別技術(shù)成為肉類市場發(fā)展的迫切需求。動物源性食品種屬鑒別通常依據(jù)外觀和氣味進行感官判別，但無法滿足監(jiān)管需要。實驗室分析方法主要是以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析法、免疫層析試紙條法[1-4]和以核酸檢測為基礎(chǔ)的聚合酶鏈式反應[5-8]。近幾年近紅外光譜技術(shù)也被用于鑒別原料肉的摻假[9-10]。然而這些檢測方法損壞樣品、費時費力且易受水分的影響，不能滿足口岸肉類種屬和摻假鑒別的時效性和可靠性要求。

拉曼光譜技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種分子光譜分析技術(shù)，它可提供分子振動和轉(zhuǎn)動的信息，屬于分子指紋光譜，是分析物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的理想工具，已在毒品檢測、考古、石油化工、材料、醫(yī)學、藥物和環(huán)保等領(lǐng)域被廣泛應用[11-18]。相關(guān)研究表明，拉曼光譜技術(shù)可應用于肉類鑒別，但尚缺乏廣域照射（wide area illumination，WAI）拉曼光譜技術(shù)的報道[19-21]。WAI拉曼光譜技術(shù)是一種新型光譜技術(shù)，其激光光斑直徑遠大于傳統(tǒng)激光光斑直徑（<500 μm），極大地提高了信號收集的代表性和操作方便性[22]。Kim等[23]使用WAI拉曼系統(tǒng)（直徑6 mm）和實時強度校正方法檢測萘普生藥片中活性成分的含量，方法的重現(xiàn)性和準確度均較好。采用WAI拉曼技術(shù)采集數(shù)據(jù)時無需傳統(tǒng)拉曼光譜采集時的復雜調(diào)焦過程，這極大降低了對測試人員的專業(yè)要求。拉曼光譜為弱信號光譜，肉類樣品尤其是瘦肉樣品的拉曼效應較弱[24]。此外，采用拉曼光譜鑒別肉類種屬時對肉類組織類型具有限制性。De Biasio等[25]使用顯微拉曼光譜技術(shù)鑒別雞肉、豬肉、火雞、牛肉、馬肉和羊肉的瘦肉組織;Beattie等[26]利用拉曼光譜技術(shù)對雞肉、牛肉、羊肉和豬肉的脂肪組織進行分類。然而，同時使用原料肉中瘦肉和脂肪組織的拉曼光譜信息鑒別肉類種屬鮮有報道。

本研究同時采集動物瘦肉和脂肪組織的拉曼光譜數(shù)據(jù)，采用光譜儀降噪和波長標定（spectrometer noise reduction and wavelength calibration，SNRWC）法對數(shù)據(jù)進行降噪預處理，結(jié)合多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）和均值中心化方法進行數(shù)據(jù)前處理，采用簇類獨立軟模式（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）法建立鴨肉、羊肉和豬肉原料肉的動物種屬鑒別分析模型，同時建立真假羊肉的預測模型，以期實現(xiàn)對摻假羊肉的鑒別以及滿足口岸檢測任務的多種需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用肉類樣品均來自北京海關(guān)技術(shù)中心，樣品包含不同種屬、部位、產(chǎn)地的肉類，每種肉類樣品種屬均經(jīng)北京海關(guān)技術(shù)中心瘋牛病實驗室檢測確認。

1.2 儀器與設備

ExR810廣域拉曼光譜儀 西派特（北京）科技有限公司;KMG-W905絞肉機 康佳集團股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品信息

鴨肉、羊肉和豬肉光譜數(shù)據(jù)的數(shù)量、校正集及驗證集數(shù)據(jù)信息如表1所示。

各取羊里脊、羊后腿、羊前腿、羊腩、去骨羊肉40 g絞成肉糜，制備未摻假羊肉。以羊肉質(zhì)量計，分別添加20%、30%、40%、100%的鴨肉制備摻假羊肉。肉糜制作時，使用絞肉機（板孔直徑5 mm）絞碎，每個樣品絞碎時間約2 min，重復2 次。通過肉眼分辨肉糜的紅白顏色差異，選取28 個未摻假羊肉樣品;同樣按照肉糜顏色差異，從各比例摻假羊肉中分別選取6 個肉糜樣品，共24 個。未摻假羊肉和摻假羊肉樣品數(shù)量、校正集及驗證集數(shù)據(jù)信息如表2所示。

1.3.2 拉曼光譜數(shù)據(jù)采集

將樣品置于樣品臺上，設定積分時間10 s，平均次數(shù)6 次，功率等級10 級，拉曼光譜掃描范圍157～3 645 cm-1。

采集并保存每個樣品的拉曼光譜數(shù)據(jù)。

由圖1可知，不同種屬動物脂肪組織的拉曼光譜數(shù)據(jù)差異較大。動物脂肪組織中脂肪含量在90%以上，水分含量約6%，蛋白質(zhì)含量約2.2%，因此其拉曼光譜數(shù)據(jù)主要來源于脂肪。動物脂肪組織在800～1 800 cm-1范圍內(nèi)拉曼譜帶的大致分布如表3所示。3 種原料肉的脂肪組織在部分峰型和峰強度上具有明顯差異，如在1 266 cm-1

處的順式烯烴H彎曲，羊肉峰強度相對較弱，豬肉和鴨肉峰強度較強;在1 126 cm-1處的C-C伸縮振動，鴨肉峰強度很弱，羊肉和豬肉峰強度相對較強;在920 cm-1處，由于具有多種振動模式，3 種原料肉的脂肪組織有較大不同;3 種原料肉脂肪組織在1 656 cm-1處的C=C伸縮譜帶與1 742 cm-1處的C=O伸縮譜帶或1 440 cm-1處的-CH2-剪切振動譜帶的強度比值不同，常用此比值來定量分析脂肪的不飽和度[28]。

不同種屬動物瘦肉組織的拉曼光譜數(shù)據(jù)如圖2所示。動物瘦肉組織中蛋白質(zhì)含量約20%，脂肪含量1%～15%，脂肪含量視瘦肉種類的不同而不同，無機鹽1%，另有微量維生素和水分。肉色主要取決于肉中肌紅蛋白和血紅蛋白的含量及化學狀態(tài)。與動物脂肪組織不同，動物瘦肉組織的拉曼光譜信號來源比較復雜，主要是蛋白質(zhì)和脂肪拉曼光譜信號的疊加。因此，結(jié)合化學計量學中的多變量判別工具，可將拉曼光譜數(shù)據(jù)作為原料肉種屬定性鑒別和摻假肉鑒定的依據(jù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)預處理

拉曼光譜數(shù)據(jù)在采集過程中因受到熒光、樣品平整度、環(huán)境中光線等因素的影響，光譜會出現(xiàn)不同程度的基線漂移;并且瘦肉樣品拉曼光譜信號弱，從而使光譜信噪比降低，因此這些因素均會影響檢測結(jié)果。本實驗采用MSC、SNRWC與均值中心化法對光譜數(shù)據(jù)進行預處理，MSC法可以校正基線的平移和偏移現(xiàn)象[29]。SNRWC法通過調(diào)整橫坐標將譜線頻率調(diào)整至統(tǒng)一值f

（f為移動窗口尺寸），濾波后再將坐標恢復或標定至統(tǒng)一值，此方法可有效去除光譜數(shù)據(jù)的隨機噪聲，顯著提高數(shù)據(jù)信噪比且不會使數(shù)據(jù)失真。均值中心化法是將樣品光譜數(shù)據(jù)減去校正集的平均光譜數(shù)據(jù)，以增加樣品光譜之間的差異，從而提高模型的穩(wěn)健性和預測能力[30]。數(shù)據(jù)預處理方法程序均采用MATLAB（R2017b）軟件編寫。

1.3.4 SIMCA分類法

SIMCA分類法又稱相似分析法，是建立在主成分分析（principle component analysis，PCA）基礎(chǔ)上的一種模式識別法，即利用樣品在主成分空間中與不同類別樣品的類距離進行歸類判別[31]。該方法包括2 個主要步驟，

第1步選定已知類別的訓練集，并對訓練集樣本的原始光譜矩陣進行降維處理，建立每一類別的PCA模型;第2步是以未知樣本逐一擬合各類SIMCA主成分模型，進行歸類判別[32-33]。SIMCA算法程序采用MATLAB（R2017b）軟件編寫。定性識別準確率按下式計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉曼光譜數(shù)據(jù)預處理結(jié)果

由圖3可知，由于樣本本身的熒光效應以及激光照射區(qū)域樣品表面凹凸不平，樣本拉曼光譜有明顯的基線漂移和光譜散射現(xiàn)象。由于瘦肉樣本中水分含量較高，脂肪和蛋白質(zhì)含量較低，拉曼信號較弱，噪聲較大。因此，需要采取合適的光譜預處理方法消除樣品散射帶來的基線漂移以及噪聲對定性識別帶來的影響。

利用MSC法和SNRWC法對鴨肉、羊肉、豬肉3 種原料肉的203 個光譜數(shù)據(jù)進行預處理。采用MSC法計算校正集樣品的平均光譜值，以此平均光譜值作為標準光譜值。將每個樣品的光譜值與標準光譜值進行一元線性回歸分析，計算各樣品光譜值相對于標準光譜值的線性和傾斜平移量，最后將每個樣品的原始光譜值減去線性平移量并除以傾斜平移量，使每個樣品光譜的基線平移和偏移都在標準光譜值的參考下得到修正。光譜降噪時將SNRWC法中的移動窗口尺寸設為27，以降低光譜的隨機噪聲和完好保留光譜信號。由圖4可知，MSC法有效降低了光譜間的散射，而SNRWC法則明顯降低了拉曼光譜的噪聲。

2.2 PCA分析結(jié)果

為考察不同原料肉及真假肉樣光譜的差異及各類樣品的聚類趨勢，首先用無監(jiān)督識別模式的PCA法分別對3 種不同原料肉樣的203 個原始光譜數(shù)據(jù)和真假羊肉樣品的52 個原始光譜數(shù)據(jù)進行分析，3 種原料肉和真假羊肉樣品的前3 個主成分的累計貢獻率分別為98.67%、99.62%。由圖5可知，3 種原料肉和真假羊肉樣品均沒有明顯的聚類趨勢。

利用MSC結(jié)合SNRWC法對3 種原料肉203 個樣本和真假羊肉52 個樣品數(shù)據(jù)進行前處理后再作PCA，得到3 種不同原料肉和真假羊肉樣品的前3 個主成分累計貢獻率分別為96.69%、97.10%。由圖6可知，MSC結(jié)合SNRWC法對光譜數(shù)據(jù)處理后，樣品之間有明顯的聚類趨勢，但仍有小部分樣品存在一定程度的重疊。

2.3 SIMCA法定性分析結(jié)果

2.3.1 原料肉鑒別

SIMCA定性分析是基于PCA基礎(chǔ)上的有監(jiān)督模式識別方法。首先從3 種原料肉203 個樣本中選擇166 個建立訓練集，其余37 個樣本均用于驗證定性模型的預測效果。數(shù)據(jù)經(jīng)過前處理后，對訓練集樣本的光譜矩陣進行PCA，采用SIMCA法分別建立3 種原料肉的定性分析模型。為充分利用光譜中的有效信息并避免過擬合，需選擇合適的主因子數(shù)。通過交叉驗證計算預測殘差平方和，確定鴨肉、羊肉和豬肉3 種原料肉的主因子數(shù)分別選取6、6、8。

建立不同種屬肉類樣品的SIMCA主成分模型，以Q與T2衡量樣本與模型的擬合程度。Q為樣本與PCA模型中主成分投影之間的殘差，用于評價樣本與模型擬合程度;T2用于描述樣本在PCA模型內(nèi)部的遠離程度。經(jīng)過有效的數(shù)據(jù)前處理以及結(jié)合SIMCA分類方法分別建立鴨肉、羊肉和豬肉的定性分析模型。由圖7可知，3 種原料肉SIMCA主成分模型均可將3 種原料肉明顯區(qū)分。這說明通過化學計量學方法可有效提取不同種屬肉類樣品的光譜信息，如脂肪酸不飽和度、蛋白質(zhì)組成以及結(jié)構(gòu)等方面的信息，實現(xiàn)對原料肉種屬的鑒別。

為驗證原料肉SIMCA主成分模型的預測效果，對驗證集37 個樣本的光譜數(shù)據(jù)進行預測分析。由表4可知，3 種原料肉的識別正確率均為100%，這表明所建立的SIMCA定性識別模型對3 種原料肉種屬具有較好的識別能力。

2.3.2 未摻假羊肉與摻假羊肉樣品的鑒別結(jié)果

采用SIMCA法分別建立未摻假與摻假羊肉的SIMCA主成分模型，2 種樣品主因子數(shù)均選擇3。由圖8可知，數(shù)據(jù)經(jīng)前處理后，未摻假與摻假羊肉的SIMCA主成分模型均可有效將未摻假和摻假羊肉分開。

為驗證真假羊肉SIMCA模型的預測效果，采用定性模型對驗證集中5 個未摻假羊肉和4 個摻假羊肉樣品進行預測，由表5可知，識別正確率均為100%。

3 結(jié) 論

本研究應用WAI拉曼光譜技術(shù)對不同種屬肉類樣品進行分類判別。將采集的拉曼光譜數(shù)據(jù)經(jīng)MSC法和SNRWC法處理后，利用PCA法提取樣品光譜主成分以考察樣品之間的聚類趨勢。PCA分析結(jié)果顯示大部分鴨肉、羊肉、豬肉樣品都能得到較好分離，同時未摻假和摻假羊肉也有明顯的聚類趨勢，但未能完全區(qū)分。在前期數(shù)據(jù)前處理和PCA分析基礎(chǔ)上，建立SIMCA定性分類模型，對37 個鴨肉、羊肉和豬肉樣品種屬進行定性鑒別，識別正確率均達100%。對4 個摻假羊肉和5 個未摻假羊肉樣品鑒別正確率亦為100%。單個樣品檢測時間可控制在2 min以內(nèi)，即放即測，操作簡便。因此，采用WAI拉曼光譜技術(shù)和有效的數(shù)據(jù)前處理方法以及結(jié)合SIMCA算法可快速識別不同種屬肉類樣品和鑒別肉類摻假情況，有利于推進口岸檢測任務前移。

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