玫煙色棒束孢IF-1106菌株液體培養(yǎng)條件優(yōu)化

鄧 歡，高亞婷，田 晶

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea），又稱為玫煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus），屬于子囊菌門肉座菌目蟲草菌科棒束孢屬[1]。它是一種寄生在昆蟲身上的真菌，在自然界中可寄生在鱗翅目、雙翅目、膜翅目等多種昆蟲上，具有廣泛的寄主范圍，可對多種昆蟲起致病作用[2-5]，尤其對刺吸式口器害蟲具有良好的致病性[6]，被廣泛用于生物防治[7]。

昆蟲病原真菌玫煙色棒束孢主要通過固體發(fā)酵和液體發(fā)酵進(jìn)行一定的繁殖、生產(chǎn)加工并用于實際生活[8-9]。目前，國內(nèi)外對玫煙色棒束孢的研究報道主要在生物學(xué)、致病力測定、致病機(jī)制、防治應(yīng)用等方面[10-12]。在不同的培養(yǎng)條件下，菌株的菌絲生物量、產(chǎn)孢量存在一定的差異[13]，因此，研究玫煙色棒束孢菌株菌絲生物量及產(chǎn)孢量的培養(yǎng)條件，是利用菌株進(jìn)行生物防治的基礎(chǔ)[14]。

本研究通過正交試驗，探究玫煙色棒束孢最適液體培養(yǎng)條件，以擴(kuò)大培養(yǎng)該菌，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢IF-1106菌株，分離自山西省太谷縣溫室大棚中，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.7514。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；液體條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基：0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，1.0 g KH2PO4，0.1 g FeSO4·7H2O。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法 將玫煙色棒束孢IF-1106菌株試管斜面放置，保存在4℃冰箱中。在需要使用時，將其取出并在室溫下活化24 h，接種在PDA培養(yǎng)基上，并且25℃培養(yǎng)于霉菌培養(yǎng)箱中[15]。當(dāng)菌株長滿培養(yǎng)皿的2/3時取出培養(yǎng)皿。

1.2.2 種子母液的制備 接種在PDA培養(yǎng)基上的菌株培養(yǎng)10 d后，用0.1%的吐溫-80無菌水稀釋，配制成孢子懸浮液[16]，并將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為1×107cfu/mL。

1.2.3 菌絲生物量和產(chǎn)孢量的測定 在無菌條件下，將50 mL液體培養(yǎng)基加入到250 mL三角瓶中，按5%的接種量接入種子母液，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，7 d后在顯微鏡下用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)；將濾紙烘干至恒質(zhì)量，對菌絲進(jìn)行過濾后用蒸餾水洗滌，在60℃烘箱中烘干，用電子天平稱質(zhì)量[17]，測定菌絲生物量。

1.2.4 最適碳源和氮源組合的確定 以葡萄糖和蔗糖為碳源，蛋白胨和硝酸鈉為氮源，將碳源、氮源與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合，形成玫煙色棒束孢菌株液體培養(yǎng)的4種培養(yǎng)液，分別對菌株進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)其菌絲生物量和產(chǎn)孢量確定菌株生長的最適碳源和氮源，菌絲生物量和產(chǎn)孢量的測定方法同1.2.3。

1.2.5 單因素試驗 在確定最適碳源和氮源為蔗糖和蛋白胨后，對蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時間3個因素分別進(jìn)行單因素試驗。

1.2.5.1 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 在0.2%的蛋白胨及基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2%、3%、4%、5%、6%的蔗糖，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次，培養(yǎng)6 d后測定其菌絲生物量和產(chǎn)孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.5.2 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 在5%的蔗糖及基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次，培養(yǎng)6 d后測定其菌絲生物量和產(chǎn)孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.5.3 培養(yǎng)時間的確定 將5%的蔗糖、0.2%的蛋白胨及基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合成培養(yǎng)液，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，從第5天開始每隔24 h取3瓶培養(yǎng)液，測定其菌絲生物量和產(chǎn)孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.6 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個因素選取較佳的3個水平進(jìn)行正交試驗，因素與水平列于表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0軟件計算試驗數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用Duncan新復(fù)極差法比較均值的差異顯著性。

表1 因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源和氮源組合結(jié)果

從圖1、2可以看出，不同的碳源和氮源組合的產(chǎn)孢量和菌絲生物量均不同，且差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)蔗糖、蛋白胨為碳源和氮源時，其菌絲生物量和產(chǎn)孢量均達(dá)最大值，分別為16.93 mg/mL和7.27×107cfu/mL。因此，蔗糖和蛋白胨為菌株的最適碳源和氮源。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 庶糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 從圖3、4可以看出，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時，菌絲生物量和產(chǎn)孢量均達(dá)最大值，分別為7.7mg/mL和6.67×107cfu/mL。當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于或高于5%時，菌絲生物量和產(chǎn)孢量均降低。由于蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、5%、6%時，菌絲生物量和產(chǎn)孢量均較大，所以，選擇這3個蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為正交試驗的因素和水平。

2.2.2 蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 由圖5、6可知，不同氮源條件下菌絲生物量及產(chǎn)孢量差異顯著（P＜0.05）。蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，菌絲生物量和產(chǎn)孢量差異性最顯著，均為最大值，分別為11 mg/mL和11.43×107cfu/mL。由于0.5%、1.0%、1.5%這3個蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)較接近，所以，選擇這3個蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為正交試驗的因素和水平。

2.2.3 培養(yǎng)時間的確定 由圖7、8可知，不同培養(yǎng)時間下菌絲生物量及產(chǎn)孢量差異明顯（P＜0.05）。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲生物量及產(chǎn)孢量均呈上升趨勢，到第6 d時，菌絲生物量、產(chǎn)孢量達(dá)到最大值，分別為17.27 mg/mL和7.8×107cfu/mL，此后菌絲生物量及產(chǎn)孢量均又呈下降趨勢。由于5、6、7 d這3個培養(yǎng)時間較接近，所以，選擇這3個培養(yǎng)時間作為正交試驗的因素和水平。

2.3 正交試驗結(jié)果

表2 菌絲生物量正交試驗結(jié)果

從表2、3可以看出，影響玫煙色棒束孢的菌絲生物量和產(chǎn)孢量大小順序均為：培養(yǎng)時間＞氮源＞碳源。根據(jù)極差分析得出，菌絲生物量和產(chǎn)孢量的最優(yōu)培養(yǎng)條件不完全一致，獲得最多菌絲生物量的最優(yōu)組合為A2B3C2，即蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、培養(yǎng)時間6 d；獲得最多產(chǎn)孢量的最優(yōu)組合為A1B1C3，即蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、培養(yǎng)時間7 d，以此為試驗條件得出產(chǎn)孢量為7.53×107cfu/mL。

表3 產(chǎn)孢量正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

對玫煙色棒束孢IF-1106菌株而言，碳源選用蔗糖、氮源選用蛋白胨的培養(yǎng)基菌絲生物量和產(chǎn)孢量較大。通過正交試驗得出，對菌絲生物量和產(chǎn)孢量的影響因素排序均為培養(yǎng)時間＞氮源＞碳源，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、培養(yǎng)時間6 d時，菌絲生物量最大；蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、培養(yǎng)時間7 d時，產(chǎn)孢量最大。

由結(jié)果可以得出，適合菌絲生長的碳、氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)和適合產(chǎn)孢的碳、氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)是不一致的，說明適合菌絲生長的培養(yǎng)基與適合產(chǎn)孢的培養(yǎng)基是不一致的[18]。當(dāng)需要菌絲生物量多時，可以選用蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的培養(yǎng)基；當(dāng)需要產(chǎn)孢量多，制備孢子粉時，可以選用蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的培養(yǎng)基。