姜黃素類似物通過抑制17β-HSD3活性誘導前列腺癌LNCaP細胞凋亡*

韓楊，孫文慧，仲崇琦，王猛，包?；?，張羽飛，吳丹，袁曉環(huán)

(牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心，牡丹江 157011)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)于中老年人群。近年來，隨著我國日益提高的人民生活水平，人口老齡化加劇，導致我國前列腺癌的發(fā)病率和病死率呈明顯持續(xù)增長趨勢[1]。雄激素依賴性前列腺癌屬于前列腺癌的早期，其發(fā)病機制與雄激素存在重要關系，雄激素的主要成分是睪酮。有學者發(fā)現(xiàn)，存在于睪丸微粒體中的17β-羥基類固醇脫氫酶3(17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3，17β-HSD3)參與睪酮合成的最后一步[2]，在雄激素依賴性前列腺癌中17β-HSD3表達顯著上調。姜黃素(curcumin，Cur)在前列腺癌治療中發(fā)揮重要作用[3]。但是姜黃素的生物利用度較差，限制其進一步的臨床應用[4]。筆者所在課題組設計合成一系列穩(wěn)定性高的姜黃素類似物，篩選出17β-HSD3抑制劑H7，并考察H7通過抑制17β-HSD3活性誘導LNCaP細胞凋亡，為早期前列腺癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清 (德國PAN公司，批號：P130913)；噻唑藍(MTT)粉末 (北京索萊寶科技有限公司，批號：303H05-10)；IP細胞裂解液及蛋白酶抑制劑(哈爾濱新?；驒z測有限公司，批號：100956)；RPMI1640 (美國 Hyclone公司，批號：AE27856292)；實驗用抗體Anti-Bax、Anti-Bcl-2、Anti-p53、Anti-Caspase-9 (美國Abcam公司，批號：GR80570-16、GR3250598-3、GR89716-52、GR3261735-1)；Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG (美國Abcam公司，批號：GR288027-12、GR298142-9)；β-actin (美國Cell signaling公司，批號：15)；SYBR Green (美國Roche公司，批號：39088900)；RNA逆轉錄試劑盒 (美國Roche公司，批號：32460620)；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測睪酮試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：C0315090301)。

1.2主要儀器 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，高分辨質譜儀(美國 Bruker公司)，磁共振儀(美國Varian公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(美國ESCO公司)，酶標儀(美國Molecular Devices公司)，電泳槽(美國Bio Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國 UVP公司)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR，美國 Bio Rad公司)，放射性TLC(美國 BioScan 2000)。

1.3細胞 人雄激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP(中國科學院上海細胞庫)。

1.4薄層色譜(TLC)法篩選17β-HSD3選擇性抑制劑 采用TLC法檢測姜黃素類似物(H1-H9)對17β-HSD3酶活性的抑制作用[5]。分別取大鼠胎盤微粒體20 μg和人胎盤微粒體90 μg到5 mL反應管中，每管中加0.2 μmol·L-1雄烯二酮及[3H]雄烯二酮40 000 cpm，并加0.2 mmol·L-1NADPH和含0.5%聚山梨酯-20的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)250 μL，每管加不同濃度的姜黃素類似物 (H1-H9，0.002，0.02，0.2，2，5，10 μmol·L-1)，同時采用姜黃素做對照，置34 ℃培育1 h。加入預冷乙醚2 mL終止反應?；鞈? min，收集上清液到5 mL玻璃管中，用氮氣吹干。加乙醚75 μL重溶樣本，混懸1 min后，點樣在TLC板上，用放射性TLC (Bioscan AR2000)檢測放射峰值，計算睪酮轉化率，確定半數抑制濃度(IC50)，篩選17β-HSD3選擇性抑制劑。

1.5細胞培養(yǎng)及分組 人雄激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP，采用含10%胎牛血清(FBS)的RMPI培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數生長期狀態(tài)良好的細胞，采用MTT法檢測H1-H9抑制LNCaP的IC50值，確定合適的實驗條件。取長勢狀態(tài)良好的對數生長期LNCaP細胞，以每孔1×105個密度接種到6孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別加H1-H9，檢測不同化合物對LNCaP的抑制作用。然后用篩選出來的17β-HSD3選擇性抑制劑H7做后續(xù)實驗。分成4組：空白對照組(Con)、姜黃素組(Cur，150 μmol·L-1)，雄激素受體(AR)抑制劑組(5 μmol·L-1)、H7組(150 μmol·L-1)。取各組細胞，做基因和蛋白檢測實驗。

1.6MTT法檢測H7對LNCaP細胞活性的影響 取對數生長期LNCaP細胞，細胞用蛋白胰酶消化后接種于96孔板中培養(yǎng)(每孔5000個細胞)。待12 h細胞貼壁后，將96孔板中液體吸棄，分別加入終濃度為25，50，80，100，150，200，250 μmol·L-1的H7，設置不加藥物的對照組，每組設置6個復孔。然后放于37 ℃、含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12，24，48 h后，避光條件下每孔加入0.5 mg·mL-1MTT試劑。細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將孔中上清液吸棄，每孔避光快速加入DMSO 150 μL。搖床振蕩10 min充分溶解后，用酶標儀檢測板中各孔在490 nm處的吸光度(A值)，采用公示計算細胞抑制率。實驗重復3次。利用GraphPad Prism 5.0版軟件計算出IC50值，確定最佳實驗濃度梯度和作用時間。細胞抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/(對照組A值-空白組A值)× 100%。

1.7實時熒光定量PCR檢測LNCaP細胞中相關基因mRNA表達情況 取長勢狀態(tài)良好的對數生長期LNCaP細胞，按“1.5”項方法細胞培養(yǎng)和分組。加藥24 h，將6孔板中培養(yǎng)液吸出棄掉，消化并收集細胞，使用mRNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，超微量核酸測定儀檢測mRNA濃度。取總RNA 1 μg，依照逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA。分別用p53，Caspase-9，Bax，Bcl-2，rps16基因的引物在Q-PCR上進行擴增(引物序列見表1)。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，進行40個循環(huán)，實驗重復3次。rps16為內參基因，根據標準曲線法分析實驗結果，計算出相關目的基因的表達量。

1.8Western blotting檢測LNCaP細胞中相關蛋白表達情況 取長勢狀態(tài)良好的對數生長期LNCaP細胞，按“1.5”項方法細胞培養(yǎng)和分組。加藥24 h，將6孔板中培養(yǎng)液吸出棄掉，用預冷PBS洗1次，加入含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上放置5 min，用刮刀刮下細胞，收集液體，充分振蕩使細胞裂解，4 ℃，12 000×g，離心15 min。收集上清液，得到細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，用上樣緩沖液稀釋蛋白，置于100 ℃沸水中煮10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。取蛋?0 μg上樣，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h。分別加入Anti-p53，Anti-Caspase-9，Anti-Bax，Anti-Bcl-2，Anti-β-actin抗體(1：1000)，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，Goat Anti-Rabbit IgG或Goat Anti-Mouse IgG(1：10 000)室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。滴加顯色液，置于成像系統(tǒng)顯影并進行分析，目的蛋白與內參的條帶灰度值之比代表各蛋白的相對表達量。

1.9ELISA 檢測LNCaP細胞中睪酮含量 用ELISA試劑盒采用競爭酶聯(lián)檢測睪酮含量。取長勢狀態(tài)良好的對數生長期LNCaP細胞，按“1.5”項方法細胞培養(yǎng)和分組。加藥24 h，收集6孔板中培養(yǎng)液，在2 ℃，1000×g離心15 min，上清液立即用于實驗。按試劑盒說明書分別加酶結合物50 μL，按同樣順序加入抗體50 μL，充分混勻，貼上不干膠封片，置37 ℃孵育1 h，洗板，靜置甩干，加顯色液A液和B液各50 μL。37 ℃顯色15 min，每孔加終止液50 μL。用酶標儀在波長450 nm處檢測各孔A值。

表1 LNCaP細胞中凋亡相關基因引物序列

2 結果

2.1篩選17β-HSD3選擇性抑制劑 采用放射性TLC法檢測H7對大鼠及人胎盤微粒體中17β-HSD3活性的抑制作用，結果見表2。H1-H9對大鼠17β-HSD3活性抑制的IC50值為(20.9±0.02)～(1120.4±124.6)μmol·L-1，對人17β-HSD3活性抑制的IC50值為(4.9±0.02)～(3140.7±165.7)μmol·L-1，其中H7的IC50值最小。說明H7對大鼠及人胎盤微粒體中17β-HSD3活性有明顯的抑制作用，而且與姜黃素組比較，H7的 IC50明顯低于姜黃素(P<0.01)。提示姜黃素類似物可有效抑制17β-HSD3的活性，并且H7效果更明顯。

表2 姜黃素類似物H1-H9對17β-HSD3活性的抑制作用(IC50)

Tab.2 Inhibition of H1-H9 on 17β-HSD3 activity(IC50)

①與Cur組比較，P<0.05；②與Cur組比較，P<0.01。

①compared with Cur group，P<0.05；②compared with Cur group，P<0.01.

2.2化合物抑制LNCaP細胞的增殖 用不同化合物(H1～H9)分別處理LNCaP細胞24 h后，MTT法考察H1～H9對LNCaP細胞活性的抑制作用，結果抑制率分別為(23.4±3.5)%，(59.5±3.4)%，(37.6±1.5)%，(39.3±3.3 )%，(29.7±2.6)%，(49.9±2.2 )%，(71.1±1.1)%，(52.4±2.5)%，(66.6±2.1)%，H7對LNCaP細胞抑制作用最明顯。

用不同濃度梯度H7分別處理LNCaP細胞12，24，48 h后，MTT法考察H7對各組LNCaP細胞活性的抑制作用，結果見圖1，隨著作用濃度的升高，抑制細胞增殖的能力增強，H7明顯抑了LNCaP細胞的活性，有顯著的濃度依賴性。另外，隨著H7對LNCaP細胞作用時間的延長，細胞活性降低，呈顯著的時間依懶性。LNCaP細胞經H7處理12，24，48 h后IC50值分別為268，150，63 μmol·L-1，見表3。根據實驗結果，后續(xù)實驗采用H7濃度為150 μmol·L-1，作用時間是24 h。

按MTT法檢測H7對LNCaP細胞活性的影響，結果見圖2。與空白對照組比較，姜黃素組，AR抑制劑組和H7組細胞存活率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，H7組比姜黃素對照組細胞中細胞存活率降低更顯著(F=22.9，P<0.05)。

2.3H7對LNCaP細胞中凋亡相關基因mRNA表達的影響 應用Q-PCR對各組LNCaP細胞內p53，Caspase-9，Bax，Bcl-2 mRNA表達情況進行檢測，結果見圖3，F(xiàn)值分別為3.8，5.9，9.4。與空白對照組比較，姜黃素組、AR抑制劑組和H7組細胞中p53，Caspase-9 RNA表達量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，H7組比姜黃素組中p53 mRNA表達量增加更顯著(P<0.01)，而且H7組比姜黃素組和AR抑制劑組中Caspase-9 mRNA表達量增加趨勢更明顯；同時，與空白對照組比較，姜黃素對照組、AR抑制劑組和H7組細胞中Bax/Bcl-2 mRNA表達量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，H7組比姜黃素組細胞中Bax/Bcl-2 mRNA表達量顯著升高(P<0.01)。說明姜黃素、AR抑制劑和H7均能不同程度增加LNCaP細胞內p53、Caspase-9、Bax/Bcl-2 mRNA的表達水平，并且H7作用效果更明顯。

2.4H7對LNCaP細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 采用Western blotting檢測H7對各組細胞p53，Caspase-9，Bax，Bcl-2蛋白表達情況，結果見圖4，F(xiàn)值分別為6.1，7.3，10.2。與空白對照組比較，姜黃素組、AR抑制劑組和H7組細胞中 p53、Caspase-9蛋白表達量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，H7組比姜黃素組細胞中P53、Caspase-9蛋白表達量增加顯著(P<0.01)，并且H7組比AR抑制劑組細胞中Caspase-9蛋白表達量增加顯著(P<0.01)。

圖1 H7抑制LNCaP細胞增殖的實驗結果

表3 H7對17β-HSD3活性的抑制作用(IC50)

Tab.3 Inhibition of H7 on 17β-HSD3 activity(IC50)

化合物12 h24 h48 hH7268.4±12.1150.0±9.663.0±6.9Cur61 307.3±107.432 789.0±124.111 692.0±98.3F18.737.18.4P<0.01<0.01<0.01

同時，與空白對照組比較，姜黃素對照組、AR抑制劑組和H7組細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，H7組比姜黃素組細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達量增加顯著(P<0.01)。說明姜黃素、AR抑制劑和H7均能不同程度增加LNCaP細胞內p53、Caspase-9、Bax/Bcl-2的蛋白表達水平，誘導LNCaP細胞凋亡，并且H7作用效果更明顯。

2.5H7對LNCaP細胞中睪酮含量的影響 采用ELISA法檢測H7對各組細胞睪酮的含量，結果見圖5，F(xiàn)=17.8。與空白對照組比較，姜黃素組，AR抑制劑組和H7組細胞中睪酮含量明顯減少(P<0.01)，H7組比姜黃素對照組細胞中睪酮含量減少更顯著(P<0.01)。

A.空白對照組；B.姜黃素組；C.AR抑制劑組；D.H7組；①與空白對照組比較，P<0.05；②與空白對照組比較，P<0.01；③與姜黃素組比較，P<0.05。

A.blank control group；B.curcumin group；C.AR inhibitor group；D.H7 group；①compared with blank control group，P<0.05；②compared with blank control group，P<0.01；③compared with curcumin group，P<0.05.

A.空白對照組；B.姜黃素組；C.AR抑制劑組；D.H7組 ；①與空白對照組比較，P<0.01；②與姜黃素組比較，P<0.01；③與空白對照組比較，P<0.05。

A.blank control group；B.curcumin group；C.AR inhibitor group；D.H7 group；①compared with blank control group，P<0.01；②compared with curcumin group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.05.

A.空白對照組；B.姜黃素組；C.AR抑制劑組；D.H7組 ；①與空白對照組比較，P<0.05；②與空白對照組比較，P<0.01；③與姜黃素組比較，P<0.01；④與AR抑制劑組比較，P<0.01。

A.blank control group；B.curcumin group；C.AR inhibitor group；D.H7 group；①compared with blank control group，P<0.05；②compared with blank control group，P<0.01；③compared with curcumin group，P<0.01；④compared with AR inhibitor group，P<0.01.

A.空白對照組；B.姜黃素組；C.AR抑制劑組；DH7組 ；①與空白對照組比較，P<0.01；②與姜黃素組比較，P<0.01。

A.blank control group；B.curcumin group；C.AR inhibitor group；D.H7 group；①compared with blank control group，P<0.01；②compared with curcumin group，P<0.01.

3 討論

姜黃素是傳統(tǒng)中藥姜黃中的主要成分[7]，具有消炎[8]、抗氧化[9]、降血脂[10]和抗癌[11]等諸多藥理作用。由于姜黃素結構中含有雙酮，導致其水溶性低，臨床應用受限[4]。本課題組以姜黃素為母體，去掉姜黃素中的雙酮結構，設計合成一系列含有哌啶酮結構的姜黃素類似物[6]，前期實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素類似物比姜黃素有更高的穩(wěn)定性，并且篩選出治療糖尿病的姜黃素類似物H8[12]，對于治療前列腺癌的化合物沒有進行深入研究。本研究顯示，H7對LNCaP細胞的體外增殖有明顯的抑制作用，且隨著H7濃度的升高，抑制LNCaP細胞增殖的能力逐漸加強，呈顯著的濃度依懶性。

早期前列腺癌幾乎都表現(xiàn)為雄激素依賴性，雄性激素能夠刺激前列腺癌細胞生長。早期前列腺癌主要有手術、放射治療以及雄激素阻斷療法。雄激素阻斷療法也稱為去勢療法(androgen deprivation therapy，ADT)，接受ADT 治療的患者最終都會對ADT 產生抗性，從而患去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)，進而增加治療難度，增大死亡風險[13]，因此早期前列腺癌防治至關重要。

前列腺癌的發(fā)生與體內雄激素分泌異常增多有關，雄烯二酮是人體內主要的雄激素前體，通過催化還原能被轉化為睪酮[14]。17β-HSD在哺乳動物中有10種亞型，其中17β-HSD3為雄激素的限速酶，在睪酮合成過程中起主導作用。17β-HSD3位于睪丸間質細胞內質網內，將雄烯二酮(經膽固醇轉化而成)氧化為睪酮，該反應是睪丸間質細胞合成睪酮酶促反應的最后一步，17β-HSD3發(fā)揮重要作用[2]。一般情況下，體內17β-HSD3發(fā)揮正常生理功能，如果17β-HSD3活性過高，會大大提高前列腺癌的發(fā)生率，因此17β-HSD3抑制劑有望成為治療前列腺癌的新靶點藥物。有學者研究，用17β-HSD3抑制劑處理被移植進LNCaP細胞的去勢雄性小鼠中，發(fā)現(xiàn)其對前列腺癌腫瘤生長的抑制率高達81%[15]。研究報道，17β-HSD3抑制劑STX2171和STX1383顯著降低血漿睪酮水平和抑制雄激素依賴性體內腫瘤生長，表明17β-HSD3抑制劑可用于激素依賴性前列腺癌的治療[16]。本實驗結果顯示，姜黃素，AR抑制劑及H7能顯著抑制LNCaP細胞內17β-HSD3的活性，且H7的抑制率效果優(yōu)于姜黃素，提示H7可能作為17β-HSD3抑制劑對前列腺癌發(fā)揮治療作用。

文獻報道，增加凋亡基因Bax/Bcl-2，p53，Caspase-9的基因和蛋白表達水平能夠治療前列腺癌[17]。本研究結果顯示，姜黃素、AR抑制劑和H7均不同程度增加LNCaP細胞中Bax/Bcl-2、p53，Caspase-9基因和蛋白的表達，誘導LNCaP細胞凋亡，且H7誘導LNCaP細胞凋亡的能力更明顯。綜上所述，姜黃素類似物H7可通過抑制雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP中17β-HSD3的活性，降低睪酮含量從而促進LNCaP細胞凋亡，可能與其抑制AR信號通路相關，但詳細機制尚需深入研究。