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    富馬酸替諾福韋艾拉酚胺片人體生物等效性及飲食對其藥動學的影響*

    2020-06-18 01:50:16勵璇瑋唐玲王燕陳紹春陳檸李樂丁黎
    醫(yī)藥導(dǎo)報 2020年6期
    關(guān)鍵詞:諾福韋艾拉藥動學

    勵璇瑋,唐玲,王燕,陳紹春,陳檸,李樂,丁黎

    (1.中國藥科大學藥物分析系,南京 210009;2.南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司,南京 211100;3.大理大學藥學與化學學院,大理 671000)

    替諾福韋艾拉酚胺(tenofovir alafenamide,TAF)是替諾福韋(tenofovir,TFV)的前體藥物,是一種治療慢性乙型肝炎(乙肝)的新型核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。該藥物由美國吉利德公司研發(fā),商品名為Vemlidy?,于2016年10月被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療成人慢性乙肝,這也是近10年來美國 FDA 批準唯一治療慢性乙肝的新藥[1]。替諾福韋艾拉酚胺作為親脂性化合物,通過口服給藥,經(jīng)轉(zhuǎn)運體進入原代肝細胞,在細胞內(nèi)因羧酸酯酶1(carboxylesterase 1,CES1)作用被水解為替諾福韋。原代肝細胞內(nèi)細胞激酶將替諾福韋磷酸化,使其轉(zhuǎn)化為具有藥理活性的替諾福韋二磷酸酯。替諾福韋二磷酸酯會嵌入到乙肝病毒的DNA逆轉(zhuǎn)錄酶中,以此抑制DNA的復(fù)制,進而阻止乙肝病毒的復(fù)制,治療慢性乙肝[2]。到目前為止,替諾福韋艾拉酚胺片在中國人體內(nèi)藥動學特征并無系統(tǒng)性研究報道。筆者在本文旨在建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法同時測定人血漿中替諾福韋艾拉酚胺及其活性代謝物替諾福韋的方法,評價富馬酸替諾福韋艾拉酚胺片國內(nèi)仿制藥與國外原研藥的生物等效性,并考察飲食對替諾福韋艾拉酚胺及其代謝物替諾福韋在健康中國人體內(nèi)藥動學特征的影響,報道如下。

    1 材料與方法

    1.1藥品與試劑 受試制劑:富馬酸替諾福韋艾拉酚胺片(石家莊龍澤制藥股份有限公司,批號:1800026151,規(guī)格:每片25 mg);參比制劑:富馬酸替諾福韋艾拉酚胺片(商品名:Vemlidy?,Gilead Sciences,Inc,規(guī)格:每片25 mg,批號:ZFTMA);富馬酸替諾福韋艾拉酚胺對照品(石家莊龍澤制藥股份有限公司,批號:1800036091,含量:99.8%);替諾福韋對照品(Toronto Research Chemicals 公司,批號:1-JMO-90-1,含量:96%);內(nèi)標富馬酸替諾福韋艾拉酚胺-d5(Toronto Research Chemicals公司,批號:12-XAL-35-3,純度:92.37%);內(nèi)標替諾福韋-d7(TLC Pharmaceutical Standards Ltd.,批號:2776-020A4,純度:96.1%);甲醇、乙腈(色譜純,Merck KGaA);甲酸(ACS-Reagent,Sigma-Aldrich公司);試驗用水為超純水(Milli-Q制備)。

    1.2儀器 高效液相色譜儀(液相泵:LC-30AD,柱溫箱:CTO-20AC,控制器:CBM-20A Lite,脫氣機:DGU-20A5R,自動進樣器:SIL-30ACMP,Shimadzu);質(zhì)譜儀(Triple QuadTM5500,Applied Biosystems/ Sciex);質(zhì)譜工作站(Analyst 1.6.3,Applied Biosystems/ Sciex);電子天平(型號:MSA6.6S-OCE-DM,Sartorius公司,感量:0.001 mg);離心機(型號:Heraeus Muitifuge X1R,Thermo Fisher公司);氮吹儀[型號:NG150-1A,科學儀器(北京)有限公司];純水儀(型號:Milli-Q,Merck Millipore公司)。

    1.3HPLC-MS/MS法的色譜條件與質(zhì)譜條件

    1.3.1色譜條件 色譜柱:Venusil ASB C18(2.1 mm×50 mm,3 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),采用梯度洗脫:0~1.5 min,2%B;>1.5~1.6 min,2%→36%B;>1.6~4.0 min,36%B;>4.0~4.1 min,36%→100%B;>4.1~5.1 min,100%B;>5.1~5.2 min,100%→2%B;>5.2~6.5 min,2%B。進樣體積:8 μL;流速:0.3 mL·min-1;柱溫:40 ℃。

    1.3.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源(ESI),在多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式下同時對替諾福韋艾拉酚胺(478.1→270.0,去簇電壓為82 V,碰撞電壓為23 V)、替諾福韋(288.1→176.1,去簇電壓為71 V,碰撞電壓為35 V)、內(nèi)標替諾福韋艾拉酚胺-d5(482.2→270.0,去簇電壓為80 V,碰撞電壓為44 V)和內(nèi)標替諾福韋-d7(295.1→183.1,去簇電壓為71 V,碰撞電壓為37 V)進行正離子檢測。

    1.4血漿樣品前處理 在冰浴條件下,取含酸血漿樣品血漿(50%甲酸水溶液=1000:10)120 μL,加入內(nèi)標工作溶液(替諾福韋艾拉酚胺-d5: 5.00 ng·mL-1,替諾福韋-d7:500 ng·mL-1)30 μL和沉淀劑甲醇-乙腈(1:1)480 μL,渦旋10 min,在4 ℃條件下以1789×g離心10 min,取上清液360 μL,氮氣吹干后用0.1%甲酸水溶液250 μL復(fù)溶,取復(fù)溶液8 μL,進行HPLC-MS/MS定量分析。

    1.5生物等效性研究 本試驗服從《赫爾辛基宣言》中規(guī)定倫理原則,經(jīng)過武漢市傳染病醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會審批同意后實施,臨床批件號為GCP-ICT-2019-29.01。所有受試者均自愿簽署知情同意書,并經(jīng)過嚴格體檢證明心、肝、腎等功能正常,無既往病史、藥物過敏史及藥物濫用史,首次給藥前14 d內(nèi)未使用過任何藥物,符合入選標準。

    1.6空腹給藥試驗方案 空腹試驗入組健康受試者42例,男27例,女15例,年齡(29.4±6.3)歲,體質(zhì)量(59.7±6.7)kg,身高(162.6±6.7)cm,平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(22.5±1.8)kg·(m2)-1。試驗采用隨機、開放、單劑量、兩制劑、三序列、三周期、部分重復(fù)交叉等效性試驗設(shè)計,每周期間清洗期為10 d,所有受試者于每周期給藥前1 d入?、衿诓》浚⒔y(tǒng)一晚餐,不禁水,隔夜空腹至少10 h。給藥當天,受試者于試驗給藥前靜脈埋留置針,給藥前1 h內(nèi)測量生命體征,然后根據(jù)隨機表空腹服用受試制劑或參比制劑1片,給藥時研究者監(jiān)督受試者將藥物放置于舌上方,水240 mL送服(需吞服切勿弄碎或咀嚼),給藥后研究者對受試者口腔進行檢查,以確保藥已被吞咽。給藥前1 h至給藥后1 h不得飲水,其他時間正常飲水,給藥后保持上身直立狀態(tài)2 h。受試者給藥后4 h內(nèi)禁食,給藥4,10 h后分別進食統(tǒng)一標準午餐和晚餐??崭乖囼炗诿恐芷诮o藥前0 h及給藥后5,10,15,20,30,45 min及1,1.25,1.5,2,3,4,5,8,12,24,48,72,96,120 h(共21個采血點),從受試者上肢靜脈采集血樣。每個采血點采集靜脈血4 mL,將之加入到預(yù)冷的含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中,在2~8 ℃條件下以2000×g離心10 min。在冰浴條件下,分取2份血漿,每份0.70 mL,置于含有50%甲酸水溶液7.0 μL的凍存管中,混勻,于-70 ℃冰箱中保存待測。

    1.7餐后給藥試驗方案 餐后試驗入組健康受試者42例,男24例,女18例,年齡(24.0±5.2)歲,體質(zhì)量(61.3±6.5)kg,身高(165.2±8.1)cm,平均BMI為(22.5±1.7) kg·(m2)-1。與空腹試驗相同,所有受試者于每周期給藥前1 d入?、衿诓》?,并統(tǒng)一晚餐,不禁水,隔夜空腹至少10 h。給藥當天,受試者于給藥前30 min時開始進食標準高脂餐(吐司60 g、培根80 g、黃油13 g、煮雞蛋110 g、薯條55 g、牛奶250 mL),并在30 min內(nèi)用餐完畢,在開始進餐后30 min(±30 s)準時服用受試制劑或參比制劑1片。餐后試驗于每周期給藥前0 h及給藥后10,20,30,45 min及1,1.25,1.5,2,2.5,3,3.5,4,5,8,12,24,48,72,96,120 h(共21個采血點),從受試者上肢靜脈采集血樣。

    1.8統(tǒng)計學方法 使用Phoenix WinNonlin 6.4版藥動學統(tǒng)計軟件以非房室法計算替諾福韋艾拉酚胺及替諾福韋的藥動學參數(shù),并根據(jù)《高變異藥物生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]對替諾福韋艾拉酚胺主要藥代學參數(shù)峰濃度(Cmax)、血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-120)和AUC0-∞進行生物等效性分析。

    2 結(jié)果

    2.1HPLC-MS/MS同時測定人血漿中替諾福韋艾拉酚胺及替諾福韋的檢測方法評價 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾替諾福韋艾拉酚胺及替諾福韋的測定。替諾福韋艾拉酚胺的標準曲線線性范圍為1.00~300 ng·mL-1,替諾福韋的標準曲線線性范圍為0.350~20.0 ng·mL-1,線性關(guān)系好;準確度及精密度結(jié)果見表1。血漿樣品中替諾福韋艾拉酚胺的提取回收率為95.2%~100.0%,替諾福韋提取回收率為75.1%~76.8%,內(nèi)標替諾福韋艾拉酚胺-d5的回收率為98.5%,內(nèi)標替諾福韋-d7回收率為75.8%。替諾福韋艾拉酚胺在225~1000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi),替諾福韋在18.0~50.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi),稀釋因子為1:5時具有良好的稀釋可靠性。含甲酸的血漿樣品(血漿:50%甲酸水溶液=1000:10)在室溫條件下放置4.9 h穩(wěn)定性良好,在冰浴條件下放置20.3 h穩(wěn)定性良好,在-70 ℃條件下5次凍融循環(huán)穩(wěn)定性良好,長期冰凍56 d穩(wěn)定性良好;血漿樣品處理后上清液在8 ℃自動進樣器中放置6 d穩(wěn)定性良好;基質(zhì)效應(yīng)(包括溶血基質(zhì)效應(yīng)與高脂基質(zhì)效應(yīng))、殘留均不影響血漿中替諾福韋艾拉酚胺及替諾福韋的準確定量。方法學驗證結(jié)果表明本方法可用于臨床試驗血漿樣品的分析。

    2.2藥動學和生物等效性評價結(jié)果

    2.2.1空腹試驗 42名健康受試者空腹口服富馬酸替諾福韋艾拉酚胺受試制劑或參比制劑后,替諾福韋艾拉酚胺平均血藥濃度-時間曲線見圖1,主要藥動學參數(shù)見表2,替諾福韋平均血藥濃度-時間曲線見圖2,主要藥動學參數(shù)見表3。采用Phoenix WinNonlin 6.4軟件評價受試制劑和參比制劑的生物等效性,結(jié)果表明,在空腹試驗中,參比制劑的替諾福韋艾拉酚胺Cmax、AUC0-120和AUC0-∞的個體內(nèi)標準差(SWR)均小于0.294,故采用平均生物等效性(Average bioequiva-lence,ABE)評價標準來評價兩種制劑的生物等效性。參比制劑與受試制劑的替諾福韋艾拉酚胺的Cmax、AUC0-120和AUC0-∞的幾何均值比值(T/R)的90%置信區(qū)間(CI)均落在80.00%~125.00%范圍內(nèi),符合生物等效性標準,具體結(jié)果見表4。作為臨床參考,活性代謝物替諾福韋的主要藥動學參數(shù)Cmax、AUC0-120和AUC0-∞的幾何均值及幾何均值比值(T/R)見表3。

    表1 日內(nèi)及日間的準確度、精密度

    質(zhì)控樣品濃度日內(nèi)準確度及精密度(n=6)測得濃度/(ng·mL-1)RERSD%日間準確度及精密度(n=18)測得濃度/(ng·mL-1)RERSD%替諾福韋艾拉酚胺 1.00 ng·mL-1 0.940±0.048-6.05.1 0.937±0.119-6.312.7 2.50 ng·mL-1 2.45±0.17-2.06.9 2.44±0.17-2.47.0 40.0 ng·mL-1 39.8±1.3-0.53.3 39.3±1.3-1.83.3 225 ng·mL-1 226±90.44.0 222±8-1.33.6替諾福韋 0.350 ng·mL-1 0.373±0.0346.69.1 0.362±0.0333.49.1 0.900 ng·mL-1 0.911±0.0501.25.5 0.910±0.0471.15.2 7.00 ng·mL-1 7.22±0.263.13.6 7.03±0.250.43.6 18.0 ng·mL-1 18.8±0.54.42.7 18.1±0.80.64.4

    3 討論

    3.1檢測方法比較 筆者在本試驗采用HPLC-MS/MS法同時測定人血漿中替諾福韋艾拉酚胺及替諾福韋的含量,由于兩化合物極性差異較大,試驗過程中嘗試多種不同型號的色譜柱,最終選擇Venusil ASB C18色譜柱,此色譜柱可使用100%水作為流動相,適用于極性化合物替諾福韋的分析,有效縮短分析時間。試驗中也對不同沉淀劑進行篩選,甲醇-乙腈(1:1)相較純甲醇、純乙腈或含酸乙腈明顯提高替諾福韋的回收率,最終建立的方法靈敏度高,替諾福韋艾拉酚胺和替諾福韋的定量下限可達1.00和0.350 ng·mL-1且專屬性良好。

    3.2血漿樣品穩(wěn)定性 在方法開發(fā)階段,發(fā)現(xiàn)替諾福韋艾拉酚胺在血漿中會逐漸轉(zhuǎn)化為其代謝物替諾福韋,這可能是由于替諾福韋艾拉酚胺作為一種磷酰胺酯在弱堿性的血漿中易水解[4]。因此,本試驗嘗試在血漿中加入不同比例的甲酸或乙酸來抑制其水解,最終選擇50%甲酸水溶液作為穩(wěn)定劑,加入比例為血漿-50%甲酸水溶液=1 000:10。穩(wěn)定性考察結(jié)果證明在含酸血漿中替諾福韋艾拉酚胺穩(wěn)定性良好,滿足臨床試驗的需求,保證本試驗藥動學數(shù)據(jù)的準確性。

    Fig.1 Mean plasma concentration-time profiles of tenofovir alafenamide after oral administration of test and reference preparation under fasting and fed conditions in 42 healthy volunteers

    Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of tenofovir after oral administration of test and reference preparation under fasting and fed conditions in 42 healthy volunteers

    3.3試驗方案設(shè)計 本研究在正式試驗前開展空腹與餐后各12例健康受試者的兩周期交叉生物等效性預(yù)試驗,獲得替諾福韋艾拉酚胺的最大個體內(nèi)變異為63.71%,為高變異藥物,參考《高變異藥物生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3],考慮采用重復(fù)交叉生物等效性試驗設(shè)計。同時根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,活性代謝物替諾福韋的t1/2約為40 h,設(shè)計清洗期為10 d,若采用四周期完全重復(fù)設(shè)計,試驗持續(xù)時間長,受試者脫落率高,故最終采用三周期部分重復(fù)交叉等效性試驗設(shè)計。根據(jù)替諾福韋艾拉酚胺的最大個體內(nèi)變異63.71%,受試制劑與參比制劑幾何均值比87.04%,把握度80%,估算有效樣本量為36例,考慮脫落率,設(shè)計樣本量為42例,即空腹和餐后試驗各42例。正式試驗結(jié)果表明,兩制劑在空腹及餐后狀態(tài)下均具有生物等效性,且正式試驗中受試制劑與參比制劑幾何均值比均約為100%,明顯優(yōu)于預(yù)試驗結(jié)果,其可能原因有:①正式試驗采用三周期部分重復(fù)交叉等效性試驗,減少由個體內(nèi)變異帶來的誤差,試驗結(jié)果更加準確;②正式試驗受試者例數(shù)是預(yù)實驗的3倍以上,其結(jié)果更具代表性;③正式試驗可能在受試者招募及臨床管理階段要求更嚴格,其結(jié)果更具科學性。

    3.4高變異藥物生物等效性試驗 當某藥物的一個或多個藥動學參數(shù)的個體內(nèi)變異系數(shù)≥30%時,此藥物稱為高變異藥物,而高變異藥物的生物等效性研究一直是藥學研究中的難題之一。若使用常規(guī)的數(shù)據(jù)分析方法與ABE評價標準,由于較大的個體內(nèi)差異,極可能發(fā)生統(tǒng)計學錯誤,導(dǎo)致評價結(jié)果的假陰性。為解決這一難題,研究者們提出例如增加樣本量、重復(fù)交叉設(shè)計和多劑量穩(wěn)態(tài)評價、放寬等效性判斷限值等解決辦法[5]。國家藥品監(jiān)督管理局于2018年6月頒布《高變異藥物生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,對高變異藥物的生物等效性研究方法和評價方式提出明確要求[3],近年來,包括本試驗在內(nèi)的多個高變異藥物生物等效性試驗[6-8]均采用其推薦的重復(fù)交叉設(shè)計及RSABE評價標準,采用科學的方法最大程度地降低了生物等效性評價的偏倚。

    表2 42例健康受試者空腹和餐后口服受試制劑與參比制劑后替諾福韋艾拉酚胺的藥動學參數(shù)

    藥品Cmax/(ng·mL-1)AUC0-120AUC0-∞(ng·h·mL-1)tmaxt1/2h空腹試驗 受試制劑268±103 146±51 149±580.466±0.1990.307±0.086 參比制劑272±134 135±52 137±520.407±0.1460.305±0.098餐后試驗 受試制劑238±166 225±96 242±911.590±1.150.601±0.465 參比制劑243±166 239±107 249±1071.620±1.030.461±0.231

    表3 42例健康受試者空腹和餐后口服受試制劑與參比制劑后替諾福韋的藥動學參數(shù)

    藥品Cmax/(ng·mL-1)測定值幾何均值(T/B)/%AUC0-120/(ng·h·mL-1)測定值幾何均值(T/B)/%AUC0-∞/(ng·h·mL-1)測定值幾何均值(T/B)/%tmaxt1/2h空腹試驗 受試制劑(T)9.94±3.169.55254±86243289±982771.20±0.2739.9±6.7 參比制劑(R)9.50±2.929.08105.18239±72229106.11272±81261106.131.12±0.3640.0±6.7餐后試驗 受試制劑(T)8.19±2.287.89262±45258303±532992.62±1.2842.2±5.3 參比制劑(R)8.23±2.457.9199.75267±4726398.10309±5630498.362.72±1.3541.9±5.3

    表4 替諾福韋艾拉酚胺的生物等效性結(jié)果

    3.5飲食影響 本試驗首次考察飲食對替諾福韋艾拉酚胺及其代謝物替諾福韋在健康中國人體內(nèi)藥動學特征的影響。與空腹給藥比較,餐后給藥替諾福韋艾拉酚胺藥物暴露量AUC0-120增加77%,Cmax降低11.2%,且tmax推遲約1.2 h,說明飲食對替諾福韋艾拉酚胺的藥動學存在明顯影響,與國外文獻[9-10]報道結(jié)果一致。同時,其活性代謝物替諾福韋在餐后狀態(tài)下tmax推遲1.6 h,但其他藥動學特征變化不明顯。導(dǎo)致替諾福韋艾拉酚胺Cmax降低而AUC0-120增加的原因可能有以下幾點:①進食后胃排空速度減慢[11],藥物到達小腸被吸收需要更多時間,tmax推遲,Cmax降低;②進食高脂餐后,可促進膽汁分泌[11],膽汁中膽酸鹽可增加親脂性化合物的溶解度,使替諾福韋艾拉酚胺生物利用度提高。③食物的存在可能抑制替諾福韋艾拉酚胺的代謝,使得餐后AUC0-120增加。本試驗的研究結(jié)果為富馬酸替諾福韋艾拉酚胺片在中國人體內(nèi)臨床安全合理用藥提供重要的參考依據(jù)。

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