慢性高原病患者血漿組織因子微粒和P-選擇素與凝血功能異常的關(guān)系研究

王卓亞，楊發(fā)滿，周紅梅，劉冀，汪元浚，李曉平，敬澤慧

本研究價值：

（1）本研究發(fā)現(xiàn)了慢性高原病患者血漿組織因子微粒（TF-MPs）和P-選擇素與血栓形成有一定的相關(guān)性，并且為慢性高原病患者血栓形成的獨(dú)立危險因素，為臨床預(yù)防和評估血栓形成找到了新的觀測指標(biāo)。

（2）本研究發(fā)現(xiàn)TF-MPs和P-選擇素與慢性高原病的血栓形成有關(guān)，但未進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其機(jī)制，僅為相關(guān)性研究，希望在以后的研究中進(jìn)一步探索。

慢性高原?。–MS）患者由于長期高原缺氧，紅細(xì)胞代償增加，血液黏稠呈高凝狀態(tài)［1］。組織因子（TF）作為體內(nèi)外源性凝血途徑的啟動因子，可以存在于細(xì)胞微粒表面形成組織因子微粒（TF-MPs），其表面的磷脂酰絲氨酸（PS）和TF具有很強(qiáng)的促凝活性。研究發(fā)現(xiàn)P-選擇素是血小板活化的標(biāo)志物［2］，P-選擇素可能是深靜脈血栓的一個重要危險因素［3］。本研究旨在了解CMS凝血功能異常和血漿TF-MPs、P-選擇素的相關(guān)性，為臨床提供更多資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年12月—2018年9月入住青海大學(xué)附屬醫(yī)院的CMS并深靜脈血栓患者20例為CMS并血栓組（CMS+T組）、CMS患者40例為CMS組。CMS+T組納入標(biāo)準(zhǔn)：CMS標(biāo)準(zhǔn)符合第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會頒布的慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；世居或移居（時間≥2年）海拔2 500 m以上的漢族男性患者；下肢靜脈CT血管造影（CTA）確診為深靜脈血栓。CMS+T組排除標(biāo)準(zhǔn)：肺動脈CTA確診為肺栓塞；真性紅細(xì)胞增多癥；骨髓增殖性疾??；由于肺部疾患及睡眠障礙導(dǎo)致的繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥；近3個月使用影響凝血功能及血小板功能藥物；心功能不全；肝、腎功能障礙；自身免疫性疾病等炎性疾??；合并有其他慢性疾病如高血壓、糖尿?。粣盒阅[瘤者。CMS組納入標(biāo)準(zhǔn)僅為CMS+T組納入標(biāo)準(zhǔn)的第一項(xiàng)和第二項(xiàng)。CMS組排除標(biāo)準(zhǔn)：深靜脈血栓；余同CMS+T組排除標(biāo)準(zhǔn)。CMS+T組患者平均年齡（46.0±8.6）歲，平均居住海拔（3 216.5±332.8）m；CMS組患者平均年齡（45.6±9.3）歲，平均居住海拔（3 387.5±413.1）m。

另選取同期于本院進(jìn)行健康體檢的高原體檢健康者28例為高原健康對照組（GY組），于運(yùn)城市中心醫(yī)院的平原體檢健康者40例為平原健康對照組（PY組）。GY組納入標(biāo)準(zhǔn)：世居或移居（時間≥2年）海拔2 500 m以上的健康漢族男性。PY組納入標(biāo)準(zhǔn)：世居或移居（時間≥2年）海拔500 m以下的健康漢族男性。GY組人群平均年齡（43.8±11.1）歲，平均居住海拔（3 228.5±314.6）m；PY組人群平均年齡（46.0±10.3）歲，平均居住海拔（419.4±282.8）m。

4組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.146，P=0.932）；4組居住海拔比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=590.736，P＜0.001）；其中CMS+T組、CMS組、GY組居住海拔均高于PY組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會通過，所有患者及健康者已簽署書面同意書。

1.2 血常規(guī)及凝血指標(biāo)的測定 抽取所有受檢者治療前空腹靜脈血2 ml置于EDTA管中，應(yīng)用全自動血細(xì)胞分析儀SYSMEXXE-2100測定血紅蛋白（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）；抽取GY組和PY組空腹靜脈血2 ml、CMS組和CMS+T組空腹靜脈血3.6 ml置于檸檬酸鈉管中，采用全自動凝血功能儀SYSMEX-CA7000測定凝血酶原時間（PT）、部分凝血酶原時間（APTT）、D-二聚體，具體操作過程按儀器操作規(guī)范和配套試劑說明書進(jìn)行。

1.3 TF-MPs測定 抽取受檢者治療前空腹靜脈血5 ml，置于EP管中，以160×g離心20 min，獲取富血小板血漿，吸取上層2/3血漿，以1 000×g離心20 min，取上清獲得乏血小板血漿。將異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗Annexin Ⅴ抗體（美國BD公司）和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗CD142抗體（美國BioLegend公司）或等量的同型對照抗體加入50 μl乏血小板血漿中，室溫孵育30 min，隨后加入1 ml磷酸鹽緩沖溶液（PBS）后采用流式細(xì)胞儀（美國BD公司-FACSCantoⅡ）檢測，標(biāo)本上機(jī)前用0.1～1.0 μm的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前向角設(shè)門，門內(nèi)收集的微粒進(jìn)行FITC和PE熒光強(qiáng)度分析。TF-MPs定義為直徑0.1～1.0 μm且CD142+/Annexin Ⅴ+的微粒。

1.4 P-選擇素測定 抽取所有受檢者治療前空腹靜脈血 5 ml，以 1 000×g 離心 10 min，取血漿放于 EP 管中，用P-選擇素試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）進(jìn)行測定。

1.5 觀察指標(biāo) 比較PY組、GY組，CMS+T組、CMS組、GY組Hb、PLT、凝血功能（PT、APTT、D-二聚體）、TF-MPs、P-選擇素，分析CMS患者TF-MPs、P-選擇素、D-二聚體、PLT間的相關(guān)性及患者發(fā)生深靜脈血栓的影響因素，并探究D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的價值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；兩個變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析；繪制D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的受試者工作特征（ROC）曲線，并計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異度等。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PY組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較 GY組Hb、P-選擇素高于PY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組PLT、PT、APTT、D-二聚體、TF-MPs比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 CMS+T組、CMS組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較 CMS+T組、CMS組、GY組Hb、PLT、PT、APTT、D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中CMS+T組、CMS組Hb高于GY組，PLT低于GY組，PT、APTT長于GY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CMS+T組D-二聚體水平高于CMS組、GY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CMS組、CMS+T組 TF-MPs、P-選 擇素高于GY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CMS+T組TF-MPs、P-選擇素高于CMS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；余指標(biāo)組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

2.3 CMS患者TF-MPs、P-選擇素、PLT、D-二聚體相關(guān)性分析 CMS患者TF-MPs、P-選擇素、PLT、D-二聚體分別為（1.41±0.45）%、（7.74±2.68）ng/L、（120.0±51.5）×109/L、（2.94±1.93）mg/L， 其 中TF-MPs與P-選擇素呈正相關(guān)（r=0.589，P＜0.001），與PLT呈負(fù)相關(guān)（r=-0.451，P=0.008），與D-二聚體無直線相關(guān)關(guān)系（r=0.228，P=0.080）；P-選擇素與PLT呈負(fù)相關(guān)（r=-0.442，P＜0.001），與D-二聚體無直線相關(guān)關(guān)系（r=0.070，P=0.560）。

2.4 CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的影響因素分析 以CMS是否發(fā)生深靜脈血栓為因變量（賦值：未發(fā)生=0，發(fā)生 =1），以Hb、PLT、PT、APTT、TF-MPs、P-選擇素為自變量（賦值見表3），進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，PT、TF-MPs、P-選擇素是CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的影響因素（P＜0.05，見表4）。

表1 PY組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較（±s）Table 1 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin between PY and GY groups

表1 PY組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較（±s）Table 1 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin between PY and GY groups

注：Hb=血紅蛋白，PLT=血小板計(jì)數(shù)，PT=凝血酶原時間，APTT=部分凝血酶原時間，TF-MPs=組織因子微粒；PY組=平原健康對照組，GY組=高原健康對照組

組別 例數(shù) Hb（g/L） PLT（×109/L） PT（s） APTT（s） D-二聚體（mg/L） TF-MPs（%） P-選擇素（ng/L）PY 組 40 148.9±13.2 203.3±45.7 11.4±1.0 29.6±7.1 0.67±0.33 0.55±0.29 2.28±0.75 GY 組 28 163.7±17.7 179.0±56.6 11.4±0.8 29.8±3.8 0.70±0.27 0.64±0.23 2.81±1.17 t值 3.950 -1.960 0.072 0.123 0.438 1.345 2.271 P值 ＜0.001 0.054 0.943 0.903 0.663 0.183 0.026

表2 CMS+T組、CMS組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較（±s）Table 2 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin among CMS+T，CMS and GY groups

表2 CMS+T組、CMS組、GY組Hb、PLT、凝血功能、TF-MPs、P-選擇素比較（±s）Table 2 Comparison of Hb，PLT，coagulation function parameters，TF-MPs and P-selectin among CMS+T，CMS and GY groups

注：CMS=慢性高原??；CMS+T組=CMS并血栓組；與GY組比較，aP＜0.05；與CMS組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) Hb（g/L） PLT（×109/L） PT（s） APTT（s） D-二聚體（mg/L） TF-MPs（%） P-選擇素（ng/L）GY 組 28 163.7±7.8 182.5±54.7 11.4±0.8 29.8±3.8 0.73±0.27 0.64±0.23 2.81±1.17 CMS 組 40 225.4±16.1a 123.0±47.4a 17.9±4.9a 43.0±10.3a 1.14±0.96 1.28±0.42a 6.96±2.21a CMS+T 組 20 221.5±11.5a 114.2±59.6a 15.3±4.4a 41.0±11.1a 6.55±4.28ab 1.65±0.42ab 9.30±2.91ab F值 315.300 13.628 22.862 18.942 19.771 46.956 58.972 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 CMS患者發(fā)生深靜脈血栓影響因素的多因素Logistic回歸分析賦值表Table 3 Assignment table of factors associated with deep vein thrombosis in CMS patients incorporated in the multivariate Logistic regression model

表4 CMS患者發(fā)生深靜脈血栓影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of factors influencing deep vein thrombosis in CMS patients

表5 D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的AUC、約登指數(shù)、最佳截?cái)嘀?、靈敏度、特異度Table 5 AUC，Youden's index，optimal cutoff value，sensitivity and specificity of D-dimer，TF-MPs and P-selectin in predicting deep vein thrombosis in CMS patients

2.5 分析D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的價值 繪制D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的ROC曲線，結(jié)果顯示，D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的AUC分別為0.939、0.727、0.732，靈敏度分別為85.0%、45.0%、70.0%，特異度分別為92.5%、87.5%、75.0%（見圖1、表5）。

圖1 D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的ROC曲線Figure 1 ROC curve of D-dimer，TF-MPs，and P-selectin for predicting deep vein thrombosis in CMS patients

3 討論

微粒是一種直徑為0.1～1.0 μm的脂蛋白，為血小板、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等在激活或凋亡過程中從細(xì)胞膜上脫落下來的片段，需要與直徑＞1.0 μm的血小板和直徑＜0.1 μm的外來雜質(zhì)相鑒別［5-6］。微粒在脂質(zhì)雙分子層中表達(dá)負(fù)電荷的PS，可為凝血過程提供必需的負(fù)離子脂質(zhì)表面。TF是外源性凝血途徑的啟動因子，既往認(rèn)為只有當(dāng)血管壁的完整性遭到破壞時TF才暴露于循環(huán)血液，通過激活凝血級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮止血作用，但近來有研究表明TF不僅表達(dá)于各種組織表面和血管外膜，還存在于循環(huán)血液中［7］。TF以微粒為載體共同構(gòu)成TF-MPs，其可與絲氨酸蛋白酶因子Ⅶ／Ⅶa結(jié)合形成雙分子復(fù)合物，并在Ⅷ因子的作用下激活Ⅹ因子轉(zhuǎn)變成Xa，使凝血酶原變成凝血酶，在血栓形成過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，TF-MPs在GY組、CMS組、CMS+T組中依次升高，提示TF-MPs與CMS和CMS并深靜脈血栓有一定的相關(guān)性。分析其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：CMS患者長期缺氧導(dǎo)致廣泛內(nèi)皮系統(tǒng)受損［8］，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮屏障作用減弱，信息傳遞及分泌能力下降，擴(kuò)血管物質(zhì)自分泌能力下降，縮血管物質(zhì)相對增加，白細(xì)胞黏附及血小板聚集度增強(qiáng)［9］，而微粒的產(chǎn)生主要來源于激活的血小板、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，CMS由于慢性缺氧損傷了血管內(nèi)皮，刺激了上述微粒的生成。本課題組同時發(fā)現(xiàn)，CMS患者內(nèi)皮細(xì)胞微粒水平升高［10］，也證明了這種推測。生理情況下TF是被加密的，只有在特定條件下被解密，從而表達(dá)促凝活性［11］。CMS患者血漿TF-MPs水平升高，推測該疾病可能導(dǎo)致TF解密，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中發(fā)現(xiàn)CMS+T組TF-MPs水平最高，考慮TF-MPs參與了CMS患者深靜脈血栓的形成。

P-選擇素由活化的血小板釋放，是血小板活化或血栓形成的特異性標(biāo)志物，可以反映凝血功能亢進(jìn)狀態(tài)下血小板的激活情況［5］，其釋放與PLT活化和內(nèi)皮細(xì)胞受損有關(guān)［3］。P-選擇素可與配體相結(jié)合進(jìn)一步介導(dǎo)活化的PLT、內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附，促進(jìn)血栓的形成［12］。SHANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)在高海拔地區(qū)居住時間＞2個月者血小板呈活化狀態(tài)，其P-選擇素明顯升高，考慮血小板活化與高原低氧有關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)PY組Hb、P-選擇素低于GY組，說明在高原低氧情況下，人體Hb呈代償性增生，同時由于高原低氧，P-選擇素升高提示血小板呈活化狀態(tài)。一般認(rèn)為，血液中P-選擇素基礎(chǔ)水平主要來源于血小板，而在疾病狀態(tài)下，高水平的P-選擇素水平主要由活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌所致，同時多種炎性遞質(zhì)可通過不同的機(jī)制增強(qiáng)人內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素mRNA和蛋白質(zhì)持續(xù)性轉(zhuǎn)錄合成［14］。而本課題組發(fā)現(xiàn)，CMS患者內(nèi)皮細(xì)胞微粒水平升高，提示內(nèi)皮受損處于活化狀態(tài)［10］。而多項(xiàng)研究證實(shí)CMS是由于內(nèi)皮受損、炎性遞質(zhì)水平升高等因素共同導(dǎo)致了CMS患者P-選擇素水平升高［15］。P-選擇素在活化的血小板表面融合并大量表達(dá)，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞最終參與血栓形成［7］，因此P-選擇素在CMS+T組最高，在CMS組、GY組和PY組依次降低。由此，筆者考慮TF-MPs、P-選擇素參與了CMS患者深靜脈血栓形成的過程。

既往研究證實(shí)，在損傷修復(fù)、實(shí)體瘤和惡性血液病中，大量的TF-MPs聚集在血小板表面形成血栓，并且該過程依賴于P-選擇素和P-選擇素配體的相互作用［16-18］，這與本研究相符，CMS患者TF-MPs、P-選擇素呈正相關(guān)。而P-選擇素作為中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的受體，使血小板與中性粒細(xì)胞黏附聚集，形成血栓，從而血小板被活化后消耗增多，破壞加速，這與國內(nèi)吳純［19］的研究結(jié)果相一致。因此血小板活化后的消耗性破壞是CMS患者PLT降低的一個重要原因，故在CMS患者中TF-MPs、P-選擇素與PLT呈負(fù)相關(guān)。

本研究及既往研究均發(fā)現(xiàn)，CMS患者PT、APTT延長，出血風(fēng)險升高，但由于長期高原低氧，紅細(xì)胞代償增加，血液黏稠呈高凝狀態(tài)，血栓發(fā)生率也同時增高，甚至有些患者會出現(xiàn)血栓栓塞性疾病合并凝血功能異常，目前臨床上采用凝血功能指標(biāo)（PT、APTT）等進(jìn)行出血預(yù)測，進(jìn)而提早干預(yù)，但在干預(yù)出血的同時如果能夠結(jié)合高凝和血栓形成的預(yù)測指標(biāo)進(jìn)行判斷，將會對臨床治療起到積極作用。目前臨床常用的指標(biāo)為D-二聚體，依據(jù)的是已經(jīng)形成血栓后在纖溶酶作用下分解后產(chǎn)生的物質(zhì)，可以說其是血栓形成和繼發(fā)纖溶的結(jié)果，而不是在血栓或高凝狀態(tài)形成之初的物質(zhì)，而血漿TFMPs、P-選擇素參與了血栓的形成，可能是血栓形成的重要物質(zhì)。筆者通過多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，TF-MPs、P-選擇素是CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的獨(dú)立危險因素，PT是CMS預(yù)防發(fā)生深靜脈血栓的保護(hù)因素，故臨床上可以通過檢測這些指標(biāo)從而進(jìn)行風(fēng)險判定，后續(xù)將繼續(xù)研究是否可以通過吸氧、降低血細(xì)胞比容、保護(hù)血管內(nèi)皮等治療降低該指標(biāo)，以期減少CMS患者發(fā)生血栓的風(fēng)險。

國外學(xué)者研究顯示，CMS患者PLT較健康人群明顯降低，同時CMS患者是血栓栓塞性疾病的高危人群［20-21］，CMS患者在PLT減少的情況下仍表現(xiàn)高凝狀態(tài)，臨床很少發(fā)現(xiàn)明顯的出血傾向［22］，推測血小板功能為活化狀態(tài)。本研究結(jié)果證明在高原低氧的情況下，血小板仍處于活化狀態(tài)，且CMS中血小板活化水平更高，這可能是CMS發(fā)生深靜脈血栓的一個因素；同時CMS患者血漿TF-MPs水平升高，其可為血栓形成提供PS及TF，促進(jìn)血栓形成。在本研究中，CMS患者P-選擇素、TF-MPs與PLT呈負(fù)相關(guān)，說明血栓發(fā)生風(fēng)險與PLT密切相關(guān)，血小板活化后的消耗性破壞可能是CMS患者PLT降低的一個重要原因。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，D-二聚體、TF-MPs和P-選擇素評估CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的靈敏度和特異度均較高，這將對CMS患者抗凝和血栓的治療起到指導(dǎo)作用。

綜上所述，長期居住在高原可引起Hb和PLT降低，且CMS患者TF-MPs、P-選擇素與PLT降低和深靜脈血栓形成有一定關(guān)系，同時PT、TF-MPs、P-選擇素是CMS患者發(fā)生深靜脈血栓的影響因素，D-二聚體、TF-MPs、P-選擇素預(yù)測CMS患者發(fā)生深靜脈血栓有一定價值。

志謝：感謝運(yùn)城市中心醫(yī)院同仁收集并提供資料。

作者貢獻(xiàn)：王卓亞進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析、結(jié)果分析與解釋、撰寫論文和論文修訂；楊發(fā)滿進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)并監(jiān)督管理；周紅梅、敬澤慧進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；汪元浚、李曉平進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；劉冀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本文無利益沖突。