秦皮滴眼液對大鼠干眼模型角膜上皮損害和眼表炎癥的療效觀察及機(jī)理研究

蘇晶，胡錦東，劉新泉，方越，董志國，王大虎

干眼的形成主要受內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境的影響，外環(huán)境主要指人們所處的不利的生活工作職業(yè)環(huán)境，例如較低相對濕度、較高空氣流量環(huán)境等。不利的環(huán)境因素存在于每個地方，尤其是干旱或半干旱有著溫?zé)釟夂虻牡貐^(qū)；此外，成千上萬的人正處于人工創(chuàng)造的各種不利的環(huán)境中，比如空調(diào)建筑、車間或飛機(jī)艙等[1]，這些環(huán)境中的人群往往更容易造成出現(xiàn)干眼相關(guān)的癥狀和表現(xiàn)。

秦皮滴眼液由秦皮和冰片組成，具有祛風(fēng)明目、清熱解毒之功效，是滬上著名中醫(yī)眼科范新孚教授祖?zhèn)髅胤剑瑫r也是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院長期使用的院內(nèi)自制試劑，對于干眼引起的眼睛干澀、灼熱、癢感、異物感及視疲勞等癥狀療效肯定，作用持久且無刺激及副作用[2]。但其作用機(jī)制尚不明確。擬通過本次實驗評價秦皮滴眼液對單純環(huán)境因素誘導(dǎo)的大鼠干眼模型角膜上皮損害和眼表炎癥的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本研究對動物的處理及實驗步驟均遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)及視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會 （association for research in vision and ophthalmology，ARVO） 關(guān)于眼科與視覺研究中心動物使用的相關(guān)規(guī)定和條例。選擇60只4～6周齡健康雌性Balb/c大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。試驗前進(jìn)行角膜熒光素染色（fluorescein staining，F(xiàn)L）檢測角膜健康情況，排除有角膜點染、潰瘍的大鼠。

以體重為區(qū)組因素隨機(jī)將大鼠分為正常對照組、干眼模型組、秦皮治療組，每組20只。

1.2 實驗方法

1.2.1溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)建立 參考Chen W等[3-5]提出的方法建立智能環(huán)境控制系統(tǒng)（intelligent control environment system，ICES）并對其加以改善創(chuàng)新，通過改裝冷風(fēng)機(jī)、隔熱材料、防潮材料、密封材料及控溫機(jī)等建立溫控模型房，同時應(yīng)用2臺高級智能除濕機(jī)，最終建立起溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使得溫度控制在（25.8±1.7）℃、相對濕度（relative humidity，RH）控制在（12.7±0.8）%。

1.2.2造模 正常對照組大鼠飼養(yǎng)于自然環(huán)境中，T 24～26℃，RH60%～75%，秦皮治療組和干眼模型組均飼養(yǎng)于溫控模型房中。秦皮治療組采用微量加液器吸取秦皮滴眼液進(jìn)行點眼，每日5次，每次2 μl，共28 d，干眼模型組和正常對照組不點眼藥水。各組大鼠在飼養(yǎng)期間給予充足飲水、混合飼料及正常日照，2 d更換墊料，保持清潔干燥。

造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：與正常對照組比較，出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的淚液分泌量減少即表明干眼造模成功。

1.2.3實驗過程 于實驗開始前和置于智能環(huán)境控制系統(tǒng)后第7 d、14 d、2l d、28 d行酚紅棉線試驗和淚液蕨樣變試驗。于第28 d完成上述檢查后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行全身麻醉，頸椎脫臼法處死大鼠，取連帶上眼瞼、下眼瞼及完整結(jié)膜的眼球，置于4%多聚甲醛中固定。

1.3 酚紅棉線試驗

酚紅棉線 （購自天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司），放大鏡下使用顯微鑷夾住酚紅棉線轉(zhuǎn)折處，將其置于大鼠下瞼結(jié)膜囊的中外1/3處，60 s后取出，測量酚紅棉線濕潤長度并記錄數(shù)據(jù)，以此作為淚液分泌量的評價指標(biāo)。

1.4 淚液蕨樣變試驗

無表面麻醉情況下采用毛細(xì)玻璃管從內(nèi)眥部吸取2 μl淚液，取樣過程不觸及角膜和結(jié)膜，以免引起刺激性淚液，將吸取的淚液小心置于干凈的載玻片上，26℃環(huán)境中待淚液自然干燥，通過光學(xué)顯微鏡觀察淚液結(jié)晶形態(tài)并照相記錄。

1.5 病理組織學(xué)檢查

各組大鼠的眼球沿角膜緣環(huán)形剪下角膜和角膜緣外3～4 mm的結(jié)膜組織，采用石蠟包埋切片，行病理組織學(xué)檢查。通過角膜蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，觀察角膜上皮細(xì)胞學(xué)形態(tài)。結(jié)膜通過過碘酸-雪夫染色法(periodicacid-schiff，PAS)染色觀察結(jié)膜杯狀細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目。

1.6 免疫熒光染色法檢測CD4＋T細(xì)胞的數(shù)量

大鼠角膜組織經(jīng)石蠟包埋后，冰凍切片3 μm，室溫放置30 min以上，用4 ℃丙酮固定10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗5 min×3次；3%過氧化氫 （hydrogen peroxide，H2O2）孵育5 min，PBS洗5 min×2次。0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）浸洗30 min；1%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）-PBS封閉30 min，傾去；加1:100稀釋的CD4+一抗（Abcam公司），置濕盒中4℃過夜；次日拿出濕盒，棄一抗，0.01mmol/LPBS（PH7.2～7.4）沖洗，3 min×3次；滴加1:100稀釋Alexa Fluor647標(biāo)記二抗 （1%BSA-PBS稀釋，Abcam公司），37 ℃孵育30 min；棄二抗，0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）洗3 min×3次；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染細(xì)胞核20 min，PBS洗3 min×3次；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用單因素方差分析處理，兩兩之間比較用Q檢驗。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酚紅棉線試驗

采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，3組大鼠的淚液分泌量在基點處相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。14 d時干眼模型組出現(xiàn)淚液減少。21 d時干眼模型組大鼠與正常對照組比較淚液分泌量減少，秦皮治療組淚液分泌量較干眼模型組多，F(xiàn)=9.988，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；第28 d時，秦皮治療組較干眼模型組淚液分泌量增多，F(xiàn)=27.769，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 淚液蕨樣變試驗

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組從第0 d至第28 d均能觀察到大鼠淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)良好；干眼模型組大鼠隨著在溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)中時間的延續(xù)，淚液蕨類結(jié)晶排列逐漸變得不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂與減少，至第28 d可見蕨類結(jié)晶較正常對照組明顯稀疏減少，甚至消失；秦皮治療組在各時間點淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)均較干眼模型組大鼠良好，但不如正常對照組蕨類結(jié)晶形態(tài)規(guī)則、密集。3組大鼠第28 d淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)（圖1）。

表1 3組大鼠的酚紅棉線試驗結(jié)果比較（）

表1 3組大鼠的酚紅棉線試驗結(jié)果比較（）

注：* 與同時間點正常對照組比較，P＜0.05；# 與同時間點干眼模型組比較，P＜0.05

圖1 3組大鼠第28 d淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)圖1A正常對照組，形態(tài)完整，連接緊密而無斷裂；1B干眼模型組，稀疏有空隙，出現(xiàn)斷裂；1C秦皮治療組，形態(tài)良好，排列緊密規(guī)則

2.3 病理組織學(xué)檢查

2.3.1角膜HE染色 第28 d光鏡下對3組大鼠角膜行HE染色后可見，正常對照組Balb/c大鼠眼球角膜上皮細(xì)胞分層良好，排列規(guī)則，基底部細(xì)胞呈柱狀排列，并且向角膜上皮逐漸分化為鱗狀上皮細(xì)胞；干眼模型組大鼠經(jīng)過28 d溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)造模后角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生，上皮明顯增厚；秦皮滴眼液治療組結(jié)構(gòu)較為良好，厚度未見明顯變化（圖2）。

圖2 3組大鼠第28 d角膜HE染色后角膜上皮細(xì)胞圖2A正常對照組，各層細(xì)胞排列整齊，分層良好；2B干眼模型組，角膜上皮增生變厚；2C秦皮治療組，厚度未見明顯變化

2.3.2結(jié)膜PAS染色第28 d對3組大鼠結(jié)膜組織進(jìn)行PAS染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見正常對照組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，杯狀細(xì)胞形態(tài)完好，均勻地分布在上皮細(xì)胞間；干眼模型組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少且排列紊亂，杯狀細(xì)胞密度明顯減少；秦皮治療組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞未見明顯異常，杯狀細(xì)胞密度較正常稍微減少（圖3）。

圖3 3組大鼠第28 d結(jié)膜組織PAS染色圖3A正常對照組，杯狀細(xì)胞（黑色箭頭）分布均勻，形態(tài)完整；3B干眼模型組，杯狀細(xì)胞計數(shù)明顯減少；3C秦皮治療組，杯狀細(xì)胞（黑色箭頭）計數(shù)未見明顯減少

各組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量比較：第28 d，干眼模型組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(83.9±20.7)個較正常對照組(175.9±33.1)個明顯減少；而秦皮治療組結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(126.2±29.1)個多于干眼模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.598，P=0.000)。

2.4 CD4+T細(xì)胞的數(shù)量

本研究通過觀察免疫熒光染色法檢測CD4+T細(xì)胞在角膜中的浸潤情況，從而反映眼表的炎癥程度。實驗發(fā)現(xiàn)，干眼模型組的大鼠角膜CD4+T細(xì)胞浸潤明顯，而秦皮治療組未見明顯的CD4+T細(xì)胞浸潤情況（圖4）。

圖4 3組大鼠第28 d角膜免疫熒光染色圖4A正常對照組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤可忽略；4 B干眼模型組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤顯著；4C秦皮治療組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤較干眼模型組少

用藥后28 d，干眼模型組大鼠的每張角膜切片中CD4+T細(xì)胞數(shù)量為（98.6±21.7)個，較正常對照組的CD4+T細(xì)胞數(shù)量(35.2±9.5)個明顯增多；而秦皮治療組角膜CD4+T細(xì)胞數(shù)量為(63.4±11.2)個，少于干眼模型組，3組組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=88.229，P=0.000)。

3 討論

目前已經(jīng)明確了炎癥與干眼的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，基于眼表組織的免疫性炎癥是干眼最本質(zhì)的病理生理改變，目前不少學(xué)者致力于中藥的免疫調(diào)節(jié)研究，認(rèn)為可以通過減少炎性細(xì)胞因子釋放，減緩杯狀細(xì)胞凋亡發(fā)揮中藥治療干眼的作用[6-8]。現(xiàn)代藥理研究表明，秦皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗腫瘤、抗凝、抗過敏、抗氧化和清除自由基及止咳平喘、利尿、止汗等作用，其毒性較低而無致突變作用[9]。秦皮中抑制病原微生物的有效成分主要為秦皮甲素和秦皮乙素，各時段不同研究表明秦皮對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、變形桿菌、福氏痢疾桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等多種致病菌均有不同程度的抑制作用[10]，秦皮水煎醇沉后制成的浸液具有抗單純皰疹病毒的作用[11]。其抗炎鎮(zhèn)痛作用主要通過降低一氧化氮和可溶性細(xì)胞間黏附分子的分泌[12]及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、前列腺素水平等調(diào)節(jié)達(dá)成。冰片具有開竅醒神，清熱散毒，明目退翳之功效，常為佐使之用，《本草衍義》[13]稱之為“獨行則勢弱，佐使則有功”。樊嵐嵐等[14]通過離體兔眼角膜實驗對冰片的促滲作用進(jìn)行了分子水平研究，證實了冰片能夠通過增加角膜上皮的通透性而有效促進(jìn)滴眼液中成分進(jìn)入前房。故對于穿透角膜能力較弱的藥物，可予以加入一定濃度的冰片而使藥物快速進(jìn)入前房發(fā)揮治療作用。

本研究通過改裝冷風(fēng)機(jī)、隔熱材料、防潮材料、密封材料及控溫機(jī)等建立溫控模型房，成功模擬了單純環(huán)境因素誘導(dǎo)的大鼠干眼模型。研究結(jié)果表明處于干燥低濕、高氣流量環(huán)境中的Balb/c大鼠出現(xiàn)了與干眼患類似的臨床表現(xiàn)，造模成功。

各種類型的干眼均會造成杯狀細(xì)胞的損失，杯狀細(xì)胞一旦損失，由其分泌的凝膠粘蛋白MUC5AC表達(dá)水平自然下降[15-16]，從而引起淚膜穩(wěn)定性下降及加快眼表水樣液蒸發(fā)，降低淚液的潤滑作用，并促發(fā)引起眼表損害和炎癥。隨著干眼的發(fā)展，干燥應(yīng)力誘導(dǎo)了一個基于免疫的持續(xù)低度眼表炎癥，炎癥引起眼表CD4+T細(xì)胞和CD11b+單核細(xì)胞招募和激活并分泌各種炎性細(xì)胞因子[17-18]，實驗的干眼模型組CD4+T細(xì)胞免疫熒光染色也表現(xiàn)出了明顯的浸潤情況，而秦皮治療組CD4+T細(xì)胞浸潤情況明顯好轉(zhuǎn)，顯示炎癥減少。本次實驗通過CD4+T細(xì)胞的檢測論證秦皮滴眼液對于干眼眼表炎癥的抑制作用，為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。