溪黃草中迷迭香酸的含量測(cè)定研究

王清，曹雨誕，陳佩東

作者單位：1江蘇省中醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京210029；

2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210046

溪黃草飲片為多年生草本植物唇形科香茶菜屬Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的地上部分，在華東及西南各省均有分布［1］?！督谊柨h民間常用草藥簡(jiǎn)編》記載溪黃草性涼、味甘苦，具有保肝利膽、清熱退黃等功效，臨床上用于治療急性膽囊炎、急性黃疸型肝炎以及食道炎等疾?。?］。近年來的研究表明，溪黃草提取物對(duì)由四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化有保護(hù)作用［3］，并可影響肝癌HepG2細(xì)胞基因的表達(dá)［4］。溪黃草中化學(xué)成分類型主要有酚類、二萜類、三萜類、黃酮類、氨基酸以及木脂素類等［5-6］。溪黃草在臨床中較為常用，在江蘇、浙江、四川、湖南等省的中藥飲片炮制規(guī)范中都收載有溪黃草飲片。近年來，溪黃草的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究有一定的進(jìn)展，對(duì)溪黃草中的二萜類、酚酸類等成分進(jìn)行了定性及定量分析研究［7-9］。為進(jìn)一步研究溪黃草中主要化學(xué)成分，本研究于2016年1月至2018年6月應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLCMS）對(duì)溪黃草中化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析，并對(duì)其中的迷迭香酸進(jìn)行了含量測(cè)定，為溪黃草的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1儀器高效液相色譜（HPLC）分析采用Waters 2695色譜儀（美國(guó)Waters公司），液質(zhì)聯(lián)用采用AB SCIEX Triple TOFTM5600系統(tǒng)進(jìn)行分析（美國(guó)AB公司），配備島津LC-20A快速液相系統(tǒng)（LC-20 ADXR泵及SIL20AXR自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司），色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。FA1104N型分析天平。

1.2試劑溪黃草飲片采購于安徽益生源中藥飲片科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)160113），安徽普仁中藥飲片有限公司（生產(chǎn)批號(hào)A151101，160101），亳州市京皖中藥飲片廠（生產(chǎn)批號(hào)151203）。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為唇形科植物溪黃草Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara。對(duì)照品：迷迭香酸（生產(chǎn)批號(hào)MUST-15082904）及槲皮素（生產(chǎn)批號(hào)MUST-15090717）購于成都曼斯特科技有限公司，咖啡酸（生產(chǎn)批號(hào)110885-200102）購于中國(guó)中藥藥品生物制品檢定所，蘆?。ㄉa(chǎn)批號(hào)YN1103SA14）購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溪黃草中化學(xué)成分定性分析

2.1.1供試品及混合對(duì)照品溶液的制備 取溪黃草飲片粉末過四號(hào)篩（250 μm，65目），稱取約1 g，以95%乙醇25 mL水浴回流1 h，放冷后過濾并取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密稱取迷迭香酸0.93 mg，槲皮素0.52 mg及咖啡酸0.48 mg對(duì)照品置于5 mL容量瓶中，分別加甲醇定容。取蘆丁2.50 mg置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇定容。分別吸取上述溶液100 μL制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC C181.7 μm（2.1×100 mm）；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸，B為甲醇，梯度洗脫。0 min，92A；0～1 min：92～88 A；1～2 min，88～82A；2～3 min，82～77 A；3～6 min，77～50 A；6～14 min，50～30 A；14～18 min，30～10 A；18～19 min，10～92 A；19～20 min，92 A。流速為0.2 mL/min，柱溫設(shè)置為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件設(shè)定為電噴霧離子源，以負(fù)離子模式掃描。干燥氣溫度設(shè)置為550℃，干燥氣流量為10 L/min，離子源溫度設(shè)置為550℃，霧化氣電壓為40 psi（1 psi＝6.895×103Pa），毛細(xì)管電壓為 4 500 V。對(duì)照品HPLC-MS圖見圖1A，樣品HPLC-MS圖見圖1B，分析結(jié)果見表1。

2.2溪黃草中迷迭香酸的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈和0.1%磷酸（25∶75），檢測(cè)波設(shè)定為330 nm，流速為1 mL/min，柱溫設(shè)定為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2溶液制備

2.2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸50.60 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋置刻度，搖勻，配置成濃度為5.06 mg/mL的溶液，即得。

圖1 溪黃草高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）及HPLC色譜圖：A為混合對(duì)照溶液總離子流圖，B為溪黃草飲片總離子流圖，C為迷迭香酸對(duì)照溶液HPLC色譜圖，D為供試品溶液HPLC色譜圖

表1 溪黃草中的化學(xué)成分分析結(jié)果

2.2.2.2供試品溶液的制備 取溪黃草飲片粉末約1 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%乙醇，稱定質(zhì)量，水浴回流1 h，放冷后以50%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量。精密吸取續(xù)濾液1 mL至10 mL容量瓶中，以50%乙醇定容至刻度，即得（HPLC色譜圖見圖1C，1D）。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取供試品及對(duì)照品溶液，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品與對(duì)照品溶液在相同的位置出峰，且未見與其它組分相互干擾。色譜圖見圖1C，1D。取供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，迷迭香酸理論板數(shù)按色譜峰計(jì)不低于3 000。

2.2.4線性關(guān)系考察 精密量取1 mL迷迭香酸對(duì)照品溶液置10 mL量瓶中，以甲醇定溶，作為母液。精密量取1 mL母液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。依次按上述操作，得到一定濃度的稀釋溶液。分別吸取上述溶液20 μL，按2.2.1中色譜條件，測(cè)定迷迭香酸峰面積，再以峰面積對(duì)其相應(yīng)的進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得到線性方程Y＝65 718 018.83X-3 868.35，r＝0.999 7，迷迭香酸在0.063～1.012 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.437 1 μg/mL，定量限為0.131 9 μg。

2.2.5精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算迷迭香酸的峰面積，結(jié)果迷迭香酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按照上述供試品溶液的制備方法制備溪黃草供試品溶液，進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算迷迭香酸的峰面積，結(jié)果迷迭香酸平均含量為0.028 5%，RSD為2.98%，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫條件下，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定同一樣品溶液，計(jì)算迷迭香酸的峰面積，結(jié)果迷迭香酸峰面積RSD為0.39%，表明迷迭香酸24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的同一批樣品0.5 g，按照上述供試品溶液的制備方法，然后加入一定量的對(duì)照品溶液，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各成分的回收率，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.9樣品含量測(cè)定 精密稱取各批次樣品，按上述供試品溶液的制備方法及色譜條件測(cè)定，每批樣品平行測(cè)定2次，計(jì)算溪黃草飲片中迷迭香酸的含量，結(jié)果見表3。

表2 迷迭香酸加樣回收率結(jié)果

表3 迷迭香酸含量高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果

3 討論

香茶菜屬植物基源植物較多，常易混淆［10］。其中常見化合物有酚酸類［11］、黃酮類及萜類物質(zhì)［12-13］，結(jié)合以往文獻(xiàn)，本研究以蘆丁、槲皮素、咖啡酸及迷迭香酸為對(duì)照溶液對(duì)溪黃草進(jìn)行了HPLC-MS分析。根據(jù)負(fù)離子模式下分子離子及碎片離子峰，對(duì)照文獻(xiàn)［14］，鑒定了其中7個(gè)化合物。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果后選用迷迭香酸進(jìn)行含量測(cè)定。

迷迭香酸可對(duì)小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用［15］，有助于改善與膽汁淤積相關(guān)的肝損傷［16］，而且具有抗炎［17］、神經(jīng)保護(hù)［18］等作用，與溪黃草的功效相吻合。同時(shí)，迷迭香酸是中藥飲片及其復(fù)方制劑常用的檢測(cè)指標(biāo)成分［19］。本研究分別考察了30%、50%、70%及95%的乙醇提?。凰『统曁崛。?0、45、60、75、90 min的提取時(shí)間；最終確定以50%乙醇作為溶劑，90℃水浴提取30 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各批次溪黃草中迷迭香酸含量在0.028%～0.035%之間，重現(xiàn)性較好，為溪黃草飲片質(zhì)量控制提供了依據(jù)。