苯丁酸鈉對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭浩，周淑妮，冉瑞智

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，

a腫瘤內(nèi)科，

b中醫(yī)心血管內(nèi)科，湖北 恩施445000

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國乳腺癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為30.69/10萬，位居女性惡性腫瘤的首位，居癌癥相關(guān)死因的第5位，我國乳腺癌病人發(fā)病年齡多在45～55歲，近些年乳腺癌發(fā)病也有明顯的年輕化趨勢，目前手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌及生物治療等為主的綜合治療是乳腺癌標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，乳腺癌及其治療損傷給女性病人心理健康和生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重的影響，乳腺癌的臨床治療療效仍有待進(jìn)一步提高［1-2］。

苯丁酸鈉（Sodium phenylbutyrate，NaPB）屬于苯丁酸鹽及其衍生物的一種，NaPB可通過抑制DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯等機(jī)制抑制多

種腫瘤細(xì)胞的生長和增殖［3］，有研究提示苯丁酸鹽抗腫瘤作用可能與乳腺癌易感基因1（Breast cancer gene 1，BRCA1）有關(guān)［4］。BRCA1是一種抑癌基因，其編碼的BRCA1蛋白在乳腺癌的發(fā)病、預(yù)防、治療及預(yù)后中起到了重要作用［5］。NaPB對乳腺癌細(xì)胞生長增殖的影響及其作用機(jī)制尚無確切結(jié)論，本實驗于2018年10月至2019年1月以MDA-MB-231細(xì)胞為研究對象，探討NaPB對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，同時通過分析NaPB對BRCA1蛋白表達(dá)的影響初步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞資源中心。NaPB（上海金錦樂實業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20171105），溶解于雙蒸水中使用［6］。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶均購于美國Gibco Life Technologies公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（美國Sigma公司生產(chǎn)，型號規(guī)格：M2128-100MG，批號20180212）。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司生產(chǎn)，批號20180503）。BRCA1抗體（型號ab213929）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體（型號ab32124）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（型號ab32503）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（型號ab8226）、過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗均購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231接種于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素和100 mg/L的鏈霉素，細(xì)胞維持培養(yǎng)于37℃、含有5%的二氧化碳、95%濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代后，離心制成單細(xì)胞懸液以備NaPB處理、增殖能力檢測、蛋白質(zhì)印跡法等后續(xù)實驗。

1.3四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測細(xì)胞增殖活力取處于對數(shù)生長期的MDAMB-231細(xì)胞接種于96孔板中（細(xì)胞濃度5.0×104/mL），過夜培養(yǎng)后加入不同劑量的NaPB（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）處理24 h、48 h和72 h后進(jìn)行實驗。每組設(shè)置5個復(fù)孔，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT結(jié)晶，搖床震蕩混勻10 min，然后在酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長，最后測定各孔的光密度（OD）值。MTT法得到各組細(xì)胞培養(yǎng)孔中OD值的復(fù)孔平均值。細(xì)胞增殖存活率＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%，實驗檢測重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以1.0×105密度接種于6孔板上，于培養(yǎng)體系中與藥物共同孵育48 h后，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入孵育緩沖液洗滌，離心，去上清液，使用500 μL上樣緩沖液（Binding buffer）懸浮細(xì)胞，然后再進(jìn)行熒光標(biāo)記，先加入5 μL Annexin V-FITC，后加入5 μL PI熒光標(biāo)記溶液，輕輕混勻，室溫下避光孵育20 min，于1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和BRCA1蛋白的表達(dá)收集實驗各組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說明于冰上裂解提取各組細(xì)胞的目標(biāo)總蛋白，按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明進(jìn)行實驗，測定各組細(xì)胞的目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度，然后經(jīng)灌膠、上樣處理后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離各組蛋白質(zhì)，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），封閉后并分別與抗人Bcl-2、Bax、BRCA1和β-actin一抗置4℃水平搖動過夜，再加入與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，洗膜、風(fēng)干后使用辣根過氧化物酶（HRP）-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯影，使用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對含量的計算和分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)的整理和分析。實驗中計量數(shù)據(jù)均以±s表示，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用Bonferroni校正法，P＜0.05（兩兩比較時P＜0.016 7）表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NaPB對MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力的影響實驗根據(jù)NaPB的劑量（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）不同將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞分為對照組（0 mmol/L NaPB組），2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組。MTT實驗結(jié)果表明NaPB作用于MDAMB-231細(xì)胞24 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細(xì)胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（82.05±7.11）%和（67.46±4.77）%，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝32.174，P＜0.001）；48 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細(xì)胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（74.33±4.46）%和（58.75±5.12）%，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝82.864，P＜0.001）；72 h后，對照組、2 mmol/L NaPB組4 mmol/L NaPB組細(xì)胞生存率分別為（100.00±0.00）%、（70.63±4.26）%和（48.98±3.59）%，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝184.127，P＜0.001）。該結(jié)果提示NaPB可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活力，且隨著劑量的增加其抑制作用有增加的趨勢。

2.2NaPB對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞學(xué)檢測MDA-MB-231細(xì)胞凋亡結(jié)果（圖1A）表明，對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組細(xì)胞的凋亡率分別為（4.25±0.89）%、（14.11±2.98）%和（32.73±1.89）%，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝166.668，P＜0.001）；兩兩比較采用Bonferroni校正法，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組細(xì)胞凋亡率均明顯低于對照組（P＝0.002；P＜0.001）；2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平結(jié)果表明，對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2蛋白相對灰度值分別為（0.78±0.02）、（0.58±0.04）和（0.39±0.02），三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝162.437，P＜0.001）；與對照組相比，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2的表達(dá)均有明顯降低（P＜0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組Bcl-2的表達(dá)低于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。凋亡相關(guān)蛋白Bax的相對灰度值對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組分別為（0.26±0.02）、（0.41±0.02）和（0.69±0.04），三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝210.437，P＜0.001）；與對照組相比，2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bax的表達(dá)均有明顯增加（P＝0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組Bax的表達(dá)高于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。各組Bcl-2和Bax蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果見圖1B。以上數(shù)據(jù)提示NaPB可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且劑量越高誘導(dǎo)作用越明顯。

2.3NaPB對MDA-MB-231細(xì)胞BRCA1蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明，應(yīng)用NaPB后MDA-MB-231細(xì)胞BRCA1的表達(dá)量顯著降低（圖2），對照組、2 mmol/L NaPB組和4 mmol/L NaPB組Bcl-2蛋白相對灰度值分別為（0.83±0.03）、（0.61±0.05）和（0.30±0.04），三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝117.348，P＜0.001）；2 mmol/L NaPB 組和4 mmol/L NaPB組BRCA1的表達(dá)均明顯高于對照組（P＝0.002；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB組BRCA1表達(dá)高于2 mmol/L NaPB組（P＜0.001）。以上數(shù)據(jù)表明NaPB可抑制乳腺癌細(xì)胞中BRCA1的表達(dá)，且高劑量抑制作用更明顯。

3 討論

化療與手術(shù)、放療并稱為惡性腫瘤的三大治療方法，乳腺癌通過化療可以達(dá)到臨床治愈或者長期生存的效果，探索新的有效的治療乳腺癌的藥物具有重要臨床意義［7］。

作為一種氨清除劑，在人體內(nèi)，苯丁酸鹽被氧化成苯乙酸鹽，再與谷氨酰胺結(jié)合以苯乙酰谷氨酰胺的形式從尿中排出，從而介導(dǎo)廢物氮的清除，目前是治療尿素循環(huán)障礙和高氨血癥的常用藥物。然而，體外和體內(nèi)研究均證明苯丁酸鹽及其衍生物具有明顯的抗腫瘤作用，其作用包括抑制腫瘤生長、侵襲和遷移，并在不同類型的實體瘤（如舌癌、惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等）以及血液腫瘤（如急性髓性白血?。┲姓T導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡［6，8-10］。苯丁酸鹽及其衍生物抗腫瘤作用的可能機(jī)制總結(jié)如下：抑制組蛋白去乙?；福℉DAC），抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)分化，抑制血管生成，抑制DNA修復(fù)，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)作用。此外，苯丁酸鹽及其衍生物的抗腫瘤作用還具有劑量依賴性和細(xì)胞類型選擇性，因此需要進(jìn)行針對不用類型的腫瘤進(jìn)行實驗研究以驗證其作用［3］。

目前尚不完全清楚NaPB在乳腺癌中的抗瘤作用，本研究通過細(xì)胞實驗初步探究了NaPB在乳腺癌藥物治療上的潛在應(yīng)用價值。結(jié)果表明NaPB能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活力，并可誘導(dǎo)其凋亡，NaPB可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降和Bax表達(dá)水平升高，NaPB的抗腫瘤作用在高劑量組中表現(xiàn)得更明顯。與本實驗的研究結(jié)果相似，孫象軍等［11-12］的研究表明NaPB可有效地抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖活力，且該作用具有劑量-時間依賴性，其作用機(jī)制可能與NaPB上調(diào)HOXA5基因mRNA表達(dá)水平影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程有關(guān)。研究人員還就NaPB對乳腺癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NaPB后可引起乳腺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞向成熟表型方向分化，降低其惡性程度，同時，NaPB可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯，影響乳腺癌細(xì)胞DNA的合成。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)NaPB可以顯著抑制HER2陽性的乳腺癌SKBR3細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)SKBR3細(xì)胞凋亡，同時，NaPB可增加抗HER2受體的單克隆抗體曲妥珠單抗治療的敏感性，NaPB的這種作用與p27Kip1蛋白的表達(dá)增加有關(guān)［13］，但是上述NaPB的作用在HER2陰性的乳腺癌HCC1937細(xì)胞中不存在，其原因可能與苯丁酸鹽抗的癌作用具有細(xì)胞類型選擇性有關(guān)。

BRCA1基因編碼的蛋白可作用于DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖與凋亡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞生命活動過程。BRCA1蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌的預(yù)后及對化療藥物敏感性的影響尚未明確，現(xiàn)有的研究結(jié)果也不一致［5，14-16］。本實驗發(fā)現(xiàn)NaPB可明顯降低乳腺癌細(xì)胞BRCA1蛋白的表達(dá)水平，該結(jié)果提示NaPB可能通過調(diào)節(jié)BRCA蛋白水平發(fā)揮抗癌作用。類似的，有研究發(fā)現(xiàn)在頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞中，苯丁酸鹽可通過降低BRCA1蛋白表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷性修復(fù)，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對順鉑的敏感性［4］。但是，有研究表明miR-185可以通過上調(diào)BRCA1的表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲［17］，分析其原因可能是BRCA1蛋白在不同藥物中的作用機(jī)制不同造成的。BRCA1蛋白可通過同源重組參與DNA雙鏈的損傷性修復(fù)，研究表明BRCA1基因突變的乳腺癌病人由于BRCA1蛋白表達(dá)量降低，造成了同源重組修復(fù)功能缺陷，可能對順鉑、卡鉑和多聚聚合酶（PARP）抑制劑等DNA損傷藥物更為敏感［18-19］，而紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡需要BRCA1蛋白參與，故BRCA1基因突變可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇耐藥，此外，BRCAl對腫瘤細(xì)胞的凋亡也具有不同調(diào)節(jié)功能［20］。

綜上所述，NaPB可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，NaPB可顯著降低乳腺癌細(xì)胞BRCA1蛋白表達(dá)水平，該結(jié)果提示NaPB可能通過調(diào)節(jié)BRCA1蛋白水平影響DNA損傷修復(fù)，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，這也是NaPB抗腫瘤的機(jī)制之一，NaPB介導(dǎo)的BRCA1途徑有望成為乳腺癌治療的作用靶點，該結(jié)論有待進(jìn)一步的研究以明確。

（本文圖1，2見插圖6-3）

圖1 苯丁酸鈉（NaPB）對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響：A為流式細(xì)胞儀檢查MDA-MB-231細(xì)胞各組凋亡情況；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)水平

圖2 苯丁酸鈉（NaPB）對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞BRCA1（乳腺癌易感基因1）蛋白表達(dá)的影響