miR-483/CREB1軸介導(dǎo)桃葉珊瑚苷抑制髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)降解的研究

楊少鋒　朱立國(guó)　李兆勇　李碩夫　郭彥濤　聶穎　張晨陽(yáng)

〔摘要〕 目的 研究miR-483/CREB1軸在桃葉珊瑚苷（aucubin， AU）抑制人退行性髓核（nucleus pulposus， NP）細(xì)胞胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）降解中的功能作用。方法 AU處理人退行性NP細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞活性、ECM相關(guān)蛋白及cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1， CREB1）的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）和Western blot檢測(cè)miR-483表達(dá)變化對(duì)CREB1豐度的影響;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（luciferase， LUC）檢測(cè)miR-483和CREB1-3'-UTR的靶向結(jié)合;CREB1過表達(dá)載體和（或）miR-483 mimics共轉(zhuǎn)染后，AU處理，檢測(cè)CREB1及ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 AU可顯著增強(qiáng)NP細(xì)胞活性（P=0.000 4），抑制ECM降解酶基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3， MMP-3）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶-5（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5， ADAMTS-5）與CREB1的表達(dá)，促進(jìn)膠原蛋白Ⅱ型膠原α1（collagen type II alpha 1 chain， COL2A1）和miR-483的表達(dá)（P<0.001）。miR-483過表達(dá)可抑制CREB1的表達(dá)（P<0.000 1），LUC實(shí)驗(yàn)表明miR-483可與CREB1-3'-UTR靶向結(jié)合。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CREB1可削弱AU對(duì)NP細(xì)胞ECM的降解的抑制作用，而miR-483可部分逆轉(zhuǎn)CREB1對(duì)AU的抑制作用。結(jié)論 AU誘導(dǎo)NP細(xì)胞表達(dá)miR-483，進(jìn)而抑制CREB1的表達(dá)，增強(qiáng)NP細(xì)胞的活性，抑制ECM的降解。

〔關(guān)鍵詞〕 桃葉珊瑚苷;髓核細(xì)胞;胞外基質(zhì);cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白;微小RNA

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R681.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.008

〔Abstract〕 Objective To study the functional role of miR-483/CREB1 axis in the inhibition of extracellular matrix （ECM） degradation in human degenerative nucleus pulposus （NP） cells by aucubin （AU）. Methods After treatment of human degenerative NP cells with AU， cell viability， ECM-related protein and cAMP responsive element binding protein 1 （CREB1） expression were measured. Quantitative real-time PCR （QPCR） and western blot were used to detect the effect of miR-483 expression on CREB1 abundance; dual luciferase reporter assay （LUC） was used to detect the targeted binding relationship between miR-483 and CREB1-3-TUR; The CREB1 overexpression vector and/or miR-483 mimics were co-transfected into NP cells， and the expression of CREB1 and ECM-related proteins was detected after AU treatment. Results AU significantly enhanced the activity of NP cells （P=0.000 4）， inhibited the expression of EMP degrading enzyme matrix metalloproteinase-3 （MMP-3） （P=0.000 3）， a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5 （ADAMTS-5） and CREB1 （P<0.000 1）， and promoted the expression of collagen type II alpha 1 chain （COL2A1） （P<0.000 1） and miR-483 （P=0.000 6）. Overexpression of miR-483 inhibited the expression of CREB1 （P<0.000 1）. LUC experiments indicated that miR-483 can bind to the CREB1-3'-UTR. Functional experiment showed that CREB1 can attenuate the inhibitory effect of AU on the degradation of ECM in NP cells， while miR-483 partially reverses the inhibitory effect of CREB1 on AU. Conclusion AU induces the expression of miR-483 in NP cells， thereby inhibiting the expression of CREB1， ultimately enhancing the activity of NP cells and inhibiting the degradation of ECM.

〔Keywords〕 aucubin; nucleus pulposus cells; extracellular matrix; cAMP responsive element binding protein 1; miRNA

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration，IDD）是椎間盤突出、下腰痛、脊柱穩(wěn)定性下降等脊柱病變的病理基礎(chǔ)，由此導(dǎo)致患者因?yàn)閲?yán)重腰痛而勞動(dòng)能力下降甚至完全喪失[1]。當(dāng)前有關(guān)IDD的發(fā)病機(jī)制研究顯示，椎間盤中髓核（nucleus pulposus， NP）細(xì)胞凋亡以及胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的過度降解是導(dǎo)致IDD發(fā)生的主要原因[2]。

中藥杜仲（Eucommia Ulmoides Oliv.）可增強(qiáng)骨密度、調(diào)節(jié)骨代謝[3]，相關(guān)研究也證明其可用于治療IDD、骨質(zhì)疏松癥和其他骨科疾病[4]。杜仲主要活性成分為桃葉珊瑚苷（aucubin， AU）。AU常用于治療骨關(guān)節(jié)炎[5]，并具有保護(hù)肝臟、抗炎、促進(jìn)血管生成、抗氧化、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化等多種功能[6-7]，但AU在IDD中的功能和作用機(jī)制還未見相關(guān)報(bào)道。

隨著近年來對(duì)非編碼RNA研究的日益深入，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也被發(fā)現(xiàn)參與IDD發(fā)病過程[8]。miRNA是一種長(zhǎng)度約22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可通過與靶基因mRNA的3-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄或誘使靶mRNA降解，從而調(diào)控靶基因表達(dá)[9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，以杜仲為主藥的補(bǔ)腎活血方可通過影響NP細(xì)胞中miR-483的表達(dá)促進(jìn)NP細(xì)胞增殖和ECM重塑[10]。結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具targetscan（www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子——cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1， CREB1）可能是miR-483的結(jié)合靶點(diǎn)，因此，本項(xiàng)目擬進(jìn)一步研究AU對(duì)NP細(xì)胞ECM重塑的影響及miR-483/CREB1軸在其中的功能作用。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的退行性NP細(xì)胞分離自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的IDD患者椎間盤組織[7]。細(xì)胞使用含有10%胎牛血清（GIBCO， USA）、鏈霉素和青霉素（Solarbio， 北京）的DMEM培養(yǎng)基（GIBCO， USA）培養(yǎng)。

miR-483 mimics/inhibitor、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）引物及試劑均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrixmetalloproteinase-3， MMP-3）抗體（貨號(hào)：ab52915）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶-5（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondinmotif-5， ADAMTS-5）抗體（貨號(hào)：ab41037）、CREB1抗體（貨號(hào)：ab32096）、Ⅱ型膠原α1（collagen type II alpha 1 chain， COL2A1）抗體（貨號(hào)：ab34712）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）抗體（貨號(hào)：ab8245）、HRP標(biāo)記的羊抗兔（貨號(hào)：ab205718）或羊抗小鼠（貨號(hào)：ab205719）二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;98%AU標(biāo)準(zhǔn)品由江萊生物提供;MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（dual luciferase reporter gene assay， LUC）試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)和Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染? 將DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的NP細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NP細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)至60%～70%的細(xì)胞密度，遵照Lipofectamine 2000的使用說明書，轉(zhuǎn)染miR-483 mimics。

1.2.2? MTT實(shí)驗(yàn)? 使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）溶解AU標(biāo)準(zhǔn)品以制備1 mmol/L的母液，再用PBS稀釋AU母液制備不同濃度的工作液。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液，并保證每孔的細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)。細(xì)胞單層鋪滿孔底后加入不同濃度的AU工作液，對(duì)照組則使用等體積的PBS，孵育24～72 h，倒置顯微鏡下觀察，之后，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，并使用PBS漂洗。二甲基亞砜溶解后測(cè)定490 nm處的吸光值。

1.2.3? Western blot實(shí)驗(yàn)? 分別使用AU（終濃度為16 μmol/L）和等體積的PBS（作為對(duì)照組）處理NP細(xì)胞，其后提取兩組細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測(cè)定MMP-3、ADAMTS-5、CREB1、COL2A1等蛋白的濃度，其后進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入相應(yīng)的蛋白一抗，4 ℃孵育12 h后洗膜，繼而加入二抗，ECL顯色，不同組別之間使用GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。

1.2.4? qPCR實(shí)驗(yàn)? 使用TRIZOL試劑提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NP細(xì)胞中的總RNA，然后使用U6-R與miR-483-RT引物（見表1）分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得qPCR檢測(cè)模板。再按照程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)，最后使用2-ΔΔCT的方法計(jì)算miR-483的表達(dá)水平。

1.2.5? 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建? 通過PCR擴(kuò)增含有miR-483與CREB1結(jié)合位點(diǎn)上下游800 bp序列的CREB1基因片段到Renilla psiCHECK-2載體下游，并命名為wtCREB1熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。其后在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變（見表1），得到mutCREB1熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。

1.2.6? LUC實(shí)驗(yàn)? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NP細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)染wt/mut CREB1熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-483 mimics及mimics NC，再培養(yǎng)48 h后，使用LUC檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞中的熒光素酶相對(duì)活性。

1.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0分析處理，最終數(shù)據(jù)為3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)的x±s，格拉布斯準(zhǔn)則去除逸出值后，兩兩比較，先進(jìn)行方差齊性Levene檢驗(yàn)，若方差齊，采用LSD-t檢驗(yàn)，不齊則采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，使用單因素方差分析進(jìn)行總均值比較，而后采用SNK法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊，改用Welch檢驗(yàn)進(jìn)行總體均值比較，而后采用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? AU最佳處理時(shí)間和濃度的選擇

分別使用0、2、8、16、32 μmol/L的AU處理退行性NP細(xì)胞24、48、72 h，其后MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NP細(xì)胞的活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和AU濃度的增高而增強(qiáng)，表明AU可提高NP細(xì)胞活性。此外，對(duì)照組和不同濃度的AU處理組在48 h時(shí)，OD490值分別為0.406±0.017、0.432±0.010、0.477±0.014、0.523±0.005、0.546±0.015。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，48 h時(shí)16 μmol/L處理組與對(duì)照組之間存在極顯著差異（P=0.000 4，見圖1），因此選擇16 μmol/L、處理48 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中AU干預(yù)條件。

2.2? AU處理對(duì)NP細(xì)胞ECM降解的影響

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5和膠原蛋白COL2A1的表達(dá)變化情況，結(jié)果使用AU處理之后，MMP-3的相對(duì)表達(dá)水平從0.994±0.084下降為0.617±0.104（P=0.0003），ADAMTS-5的相對(duì)表達(dá)水平從1.037±0.099下降為0.349±0.061（P<0.000 1），COL2A1的相對(duì)表達(dá)水平從1.023±0.028增加為1.532±0.120（P<0.000 1，如圖2A、圖2B）。以上結(jié)果表明AU處理可抑制NP細(xì)胞的ECM降解過程。

2.3? AU處理對(duì)miR-483和CREB1表達(dá)的影響

其后檢測(cè)AU處理對(duì)NP細(xì)胞中miR-483和CREB1的豐度影響，結(jié)果顯示，AU處理后miR-483的表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)（P=0.000 6，如圖2C），而CREB1蛋白的表達(dá)水平發(fā)生顯著下調(diào)（P<0.000 1，如圖2A和2B）。以上結(jié)果表明miR-483和CREB1可能在AU功能行使過程中發(fā)揮著某些作用。

2.4? NP細(xì)胞中miR-483和CREB1的靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染該mimics后，miR-483的表達(dá)上調(diào)近40倍（如圖3A）;其后通過qPCR和Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-483 mimics后NP細(xì)胞中CREB1的mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示，CREB1的mRNA和蛋白水平均發(fā)生極顯著下調(diào)（如圖3B和3C），表明細(xì)胞中miR-483的表達(dá)變化可影響CREB1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

其后通過權(quán)威在線工具targetscan預(yù)測(cè)miR-483與CREB1 mRNA之間的結(jié)合位點(diǎn)（如圖3D所示），并構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)上下游800 bp的CREB1基因片段的野生型熒光報(bào)告重組載體（wt-CREB1），并在此基礎(chǔ)上合成和構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變的突變型熒光報(bào)告重組載體（mut-CREB1）。將重組載體與miR-483 mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)NP細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)miR-483 mimics可顯著抑制轉(zhuǎn)染wt-CREB1細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性（P<0.000 1），而對(duì)轉(zhuǎn)染有mut-CREB1細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無影響（見圖3E）。

2.5? miR-483/CREB1軸在AU抑制NP細(xì)胞ECM降解中的作用驗(yàn)證

構(gòu)建CREB1過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入NP細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)效率驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該載體可顯著增強(qiáng)細(xì)胞中CREB1mRNA豐度（如圖4A）。使用CREB1過表達(dá)載體和mimics NC共轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞，其后使用AU處理，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CREB1蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，并且細(xì)胞中ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達(dá)上調(diào)，而膠原蛋白COL2A1的表達(dá)發(fā)生下調(diào);使用CREB1過表達(dá)載體和miR-483 mimics NC共轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞，AU處理后，細(xì)胞中CREB1和ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達(dá)發(fā)生降低，而COL2A1的表達(dá)則出現(xiàn)上調(diào)。表明CREB1可削弱AU對(duì)NP細(xì)胞ECM的降解的抑制作用，而miR-483可部分逆轉(zhuǎn)CREB1對(duì)AU的抑制作用。

3 討論

由IDD導(dǎo)致的各類疾病已發(fā)展為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量、威脅人類身體健康的世紀(jì)難題。其發(fā)病機(jī)制和治療方法一直是研究的焦點(diǎn)領(lǐng)域，雖然當(dāng)前基因治療、干細(xì)胞移植、生物工程治療等均取得了一定的進(jìn)展，但多數(shù)仍止步于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其臨床有效性和安全性還需進(jìn)一步評(píng)估[11]。近年來，廣大中醫(yī)學(xué)者在前人對(duì)IDD病因的相關(guān)論述基礎(chǔ)上，結(jié)合大量臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可作用于IDD發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)，延緩IDD進(jìn)程[12]。

IDD在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“痹癥”“腰痛”范疇，中醫(yī)藥治療多從腎虛、氣虛、督脈阻滯等著手[13]，而中藥杜仲性溫，具強(qiáng)筋壯骨、滋養(yǎng)肝腎的作用，因此本項(xiàng)目進(jìn)一步對(duì)杜仲在IDD治療中的功能進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲的活性成分AU可顯著增強(qiáng)退行性NP細(xì)胞的活性，并且增強(qiáng)的幅度與AU的濃度和處理時(shí)間相關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示AU處理后NP細(xì)胞中ECM降解酶MMP-3、ADAMTS-5的表達(dá)降低，而COL2A1的表達(dá)則出現(xiàn)上調(diào)，表明AU可抑制NP細(xì)胞的ECM降解。大量研究表明，表達(dá)失調(diào)的miRNA如miR-143[14]、miR-222[15]等可直接調(diào)控其靶基因的表達(dá)，影響椎間盤組織中細(xì)胞的增殖、凋亡和ECM降解過程，參與IDD發(fā)生和演進(jìn)過程。中藥如補(bǔ)腎壯督方（全方由海馬、鹿角膠、黃芪、熟地黃、細(xì)辛組成）可上調(diào)大鼠退變椎間盤組織和血漿中的miR-125a水平，延緩IDD發(fā)展[16];本課題組前期也報(bào)道了補(bǔ)腎活血方可影響NP細(xì)胞中miR-483的表達(dá)，促進(jìn)NP細(xì)胞增殖和ECM重塑[10]。

對(duì)AU抑制ECM降解的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，AU處理可顯著增強(qiáng)NP細(xì)胞中miR-483的表達(dá)、抑制CREB1的表達(dá)。QPCR和LUC實(shí)驗(yàn)表明，miR-483可靶向抑制細(xì)胞中CREB1表達(dá)，提示miR-483/CREB1軸在AU功能發(fā)揮過程中可能具有重要作用。最后通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，CREB1過表達(dá)可顯著增強(qiáng)細(xì)胞中ECM降解酶、抑制膠原蛋白的表達(dá)，而miR-483可逆轉(zhuǎn)CREB1對(duì)AU功效的抑制作用。CREB1是一種被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子，可作為轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動(dòng)子上的cAMP反應(yīng)元件相結(jié)合，促進(jìn)多種基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和生存[17]。并且CREB1可調(diào)控IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的表達(dá)參與炎癥進(jìn)程[18]，而NP細(xì)胞可通過分泌炎性因子誘導(dǎo)MMPs和ADAMTSs等ECM降解酶表達(dá)、加速IDD疾病進(jìn)程[19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，中藥杜仲的主要活性成分AU可作用于miR-483/C，REB1軸，抑制NP細(xì)胞ECM降解，延緩IDD的發(fā)展進(jìn)程。通過明確和完善AU治療IDD的具體分子機(jī)制，可為傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治IDD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并提供新的技術(shù)方法和研究思路。

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（本文編輯? 楊? 瑛）