復(fù)方ANBP對(duì)小鼠皮膚移植創(chuàng)面愈合的療效觀察

周暢　陳麗　胡晉婷　王霄霜　楊丁丁　王婷婷　高嵐天　周忠志　陳聰

〔摘要〕 目的 觀察復(fù)方ANBP[由仙鶴草（Agrimonia eupatoria， A），藕節(jié)（Nelumbo nucifera Gaertn， N），乳香（Boswellia carteri， B）和蒲黃（Pollen Typhae， P）組成]對(duì)皮膚移植創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用。方法 選用40只雌性C57BL/6小鼠，制成背部直徑1.2 cm圓形全層皮膚缺損小鼠模型，后進(jìn)行自體原位皮膚移植術(shù)，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予復(fù)方ANBP粉末敷于皮膚移植區(qū)，對(duì)照組不予處理。通過(guò)肉眼、HE染色觀察比較兩組皮膚移植區(qū)14 d及21 d時(shí)皮膚愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 （1）皮膚移植14 d、21 d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面愈合率高于對(duì)照組（P<0.05）。（2）HE染色結(jié)果：皮膚移植14 d，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組皮膚移植交界處平坦、表皮嵴淺且連接緊密;皮膚移植區(qū)表皮層變薄、新生毛囊數(shù)量較多且發(fā)育良好。皮膚移植21 d，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組皮膚移植交界處皮下組織緊密呈更強(qiáng)的收縮感;皮膚移植區(qū)毛囊更成熟、發(fā)育趨于完善，出現(xiàn)了明顯的毛干、皮脂腺等皮膚附屬器。結(jié)論 復(fù)方ANBP能夠加快皮膚移植區(qū)與周圍皮膚銜接，加速皮膚移植愈合，促進(jìn)皮膚附屬器發(fā)育及皮膚塑形，提高愈合質(zhì)量。

〔關(guān)鍵詞〕 中藥復(fù)方;皮膚移植;創(chuàng)面愈合

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.007

〔Abstract〕 Objective To observe the improvement of compound ANBP[（Agrimonia eupatoria， A），（Nelumbo nucifera Gaertn， N），（Boswellia carteri， B），（Pollen Typhae， P）] for the wound healing of skin grafting. Methods Forty female C57BL/6 mice were used to create a 1.2 cm round full-thickness skin defect wound on the back of each mouse. Autologous skin transplantation was performed and randomly divided into a control group and an experimental group. The experimental group was given compound ANBP powder applied to the skin grafting area and the control group was not treated. The skin tissue healing of the 2 groups of skin grafting at 14 d and 21 d was observed and compared by naked eye and HE staining， and the wound healing rate was calculated and statistical analysis was performed. Results （1） After 14 d and 21 d of skin grating， the wound healing rate of the experimental group was higher than the control group （P<0.05）. （2） HE staining results showed that at 14 d of skin grafting， the experimental group had a flat skin at the junction of the skin graft， and the epidermis was shallow and tightly connected; the epidermal layer of the skin graft area became thinner， and the number of new hair follicles was larger and the development was good. At 21 d of skin grating， the experimental group had a stronger contraction of the subcutaneous tissue at the skin graft junction than the control group; the hair follicle in the skin graft area was more mature and developed， and there was obvious hair shaft structure and sebaceous gland. Conclusion Compound ANBP can accelerate the connection between the skin graft area and the surrounding skin， accelerate the healing of skin grafts， promote the development of skin appendages and skin shaping， and improve the quality of healing.

〔Keywords〕 Chinese compound formula; skin grating; wound healing

皮膚移植術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的有效治療手段，但如何提高植皮后創(chuàng)面愈合率仍需進(jìn)一步探索[1-2]。目前，多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、負(fù)壓引流技術(shù)、干細(xì)胞療法均被應(yīng)用于提高皮膚移植創(chuàng)面愈合率，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[3-6]。但是，從中醫(yī)藥角度出發(fā)，將具有綜合作用的中藥應(yīng)用于皮膚移植創(chuàng)面仍然比較少見(jiàn)。

中藥ANBP是由仙鶴草（Agrimonia eupatoria，A），藕節(jié)（Nelumbo nucifera Gaertn，N），乳香（Boswellia carteri，B）和蒲黃（Pollen Typhae，P）4味中藥組成的復(fù)方制劑，是本課題組治療創(chuàng)傷的經(jīng)典中藥方，中醫(yī)認(rèn)為其具有收斂止血、活血祛瘀、消腫生肌的功效，前期研究已證實(shí)[7-8]：復(fù)方ANBP在兔耳增生性瘢痕模型和小鼠背部皮層缺損模型中有促愈抑疤作用，但其能否促進(jìn)皮膚移植創(chuàng)面愈合尚不清楚。本課題組通過(guò)觀察不同組別小鼠皮膚移植14 d、21 d時(shí)創(chuàng)面愈合情況，將兩組創(chuàng)面愈合率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究復(fù)方ANBP對(duì)皮膚移植創(chuàng)面愈合的影響，為其運(yùn)用于皮膚移植治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

選用40只成年雌性C57BL/6小鼠（4～6周、18～22 g），由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（許可證號(hào)：SYXK湘2015-0003）SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度維持在20～22 ℃。所有的小鼠飼養(yǎng)及操作均遵循國(guó)家衛(wèi)生研究院關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和使用指南。

1.2? 主要藥物、試劑與儀器

復(fù)方ANBP由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室按照本課題組已有方法制備[7]。水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，250 g/瓶;批號(hào)Q/12HB 4218-2009）;4%多聚甲醛（長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)灝揚(yáng)生物試劑經(jīng)營(yíng)部，500 mL/瓶;批號(hào)AR1068）;切片機(jī)（廠家：LEICA;型號(hào)：RM2235）;攤片機(jī)（廠家：LEICA;型號(hào)：HI1210）。

1.3? 造模與分組

完成小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，以3.5 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，于小鼠背部正中剃毛形成1個(gè)4 cm×4 cm正方形裸皮區(qū)域，用絡(luò)合碘與酒精消毒處理后在小鼠背部正中用打孔器創(chuàng)設(shè)1個(gè)直徑為1.2 cm的圓形全層皮膚缺損區(qū)域，將取下來(lái)的皮片放入準(zhǔn)備好的生理鹽水中浸潤(rùn)以保持活力。盡可能清除背部創(chuàng)口區(qū)肌肉上層無(wú)血運(yùn)的深筋膜，促進(jìn)創(chuàng)面血液循環(huán)。取出浸泡于生理鹽水中的皮片，去除皮下脂肪、筋膜、血管等皮下組織，直至皮片盡可能僅包含表皮層呈半透明狀態(tài)，將其覆蓋于創(chuàng)口處。隨后開(kāi)始植皮，用4-0的無(wú)菌縫合線、人用皮膚移植三角針進(jìn)行縫合，邊緣縫6～8針。將造模成功小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=20），將復(fù)方ANBP粉末均勻敷于實(shí)驗(yàn)組植皮區(qū)域，對(duì)照組不予處理。最后對(duì)移植區(qū)采用無(wú)菌紗布條加壓包扎，于10 d拆包。觀察到皮片成活則視為造模成功。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組有1例由于麻醉不耐受死亡，對(duì)照組中有2例由于皮片感染未能成活，均視為造模失敗停止后續(xù)觀察。

1.4? 肉眼和HE染色觀察創(chuàng)面組織變化

肉眼觀察并拍照記錄皮膚移植區(qū)皮片存活狀態(tài)。計(jì)算皮膚移植區(qū)創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面面積使用Image Pro Plus軟件測(cè)量。

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-測(cè)量時(shí)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

分別于皮膚移植14 d、21 d采用10%的水合氯醛麻醉，在小鼠背部切取以皮膚移植區(qū)為中心、深至肌層的2 cm×2 cm標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，常溫保存，分別從兩組14 d、21 d不同時(shí)間點(diǎn)選取6份標(biāo)本，送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，制成切片，行HE染色，觀察兩組皮膚移植區(qū)皮膚顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)和創(chuàng)面組織變化。

1.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)樣本間的比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。計(jì)量資料以“x±s”表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 復(fù)方ANBP對(duì)皮膚移植創(chuàng)面愈合影響的肉眼觀察

對(duì)照組：皮膚移植14 d，皮片部分紅腫，壞死組織面積大呈黃黑色，皮片下滲出物多，且與周圍正常皮膚界限明顯。皮膚移植21 d，創(chuàng)面基本愈合，但被毛稀疏，毛發(fā)顏色暗沉無(wú)光澤。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植14 d，皮片壞死面積明顯小于對(duì)照組，皮片下基本無(wú)滲出物且與周圍正常皮膚顏色一致;皮膚移植21 d，創(chuàng)面完全愈合，被毛豐富濃密，顏色黑亮。見(jiàn)圖1。

2.2? 復(fù)方ANBP對(duì)皮膚移植創(chuàng)面愈合率的影響

兩組皮膚移植術(shù)后14 d、21 d創(chuàng)面愈合率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3? HE染色觀察皮膚移植區(qū)創(chuàng)面組織變化

皮膚移植14 d，對(duì)照組皮膚移植交界處表皮嵴深淺不一、連接不平坦，皮膚移植區(qū)表皮顆粒層增厚，存在伸入真皮乳頭層的釘突，真皮層結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維走向雜亂，可見(jiàn)充血毛細(xì)血管，均勻分布大量炎癥細(xì)胞，新生毛囊較少，深筋膜結(jié)締組織排列疏松。實(shí)驗(yàn)組皮膚移植交界處表皮嵴深度均勻而平坦，真皮層膠原纖維排列有序，結(jié)構(gòu)清晰，炎癥細(xì)胞在真皮層散在分布，可見(jiàn)較多發(fā)育良好的新生毛囊，真皮淺層可見(jiàn)少量皮脂腺，深筋膜結(jié)締組織排列緊密，皮膚結(jié)構(gòu)層次更清晰（見(jiàn)圖2A-2D）。

皮膚移植21 d，對(duì)照組皮膚移植交界處膠原過(guò)度沉積，真皮組織厚而松散，皮膚移植區(qū)真皮層毛囊多但毛球發(fā)育幼稚。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植交界處膠原排列緊密規(guī)則，真皮層有明顯的張力收縮感，皮膚移植區(qū)可見(jiàn)大量發(fā)育成熟毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官較多（見(jiàn)圖2E-2H）。

3 討 論

皮膚移植術(shù)是目前臨床治療各種創(chuàng)面的有效手段，保證移植皮片的存活即提高皮膚移植愈合率是手術(shù)成功的關(guān)鍵。近年來(lái)，多種創(chuàng)新型皮膚移植技術(shù)如Meek、微粒皮膚移植技術(shù)的出現(xiàn)以及多種臨床廣泛使用于創(chuàng)傷治療的技術(shù)與療法如生長(zhǎng)因子、負(fù)壓引流技術(shù)等也被廣泛地應(yīng)用于皮膚移植的輔助治療中。然而，皮膚移植愈合過(guò)程是受多種因素影響的，不同細(xì)胞、基質(zhì)及細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程[9-12]。本課題組前期研究基礎(chǔ)證實(shí)復(fù)方ANBP應(yīng)用于臨床創(chuàng)傷愈合具有一定的療效，但其對(duì)于皮膚移植創(chuàng)面的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)肉眼觀察到與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植14 d，皮片紅腫、壞死面積小，皮片下滲出物少，且與周圍正常皮膚銜接更好，皮片存活狀態(tài)較好;皮膚移植21 d，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合，皮膚平整，質(zhì)軟且被毛豐富濃密，顏色黑亮。皮膚移植14 d、21 d實(shí)驗(yàn)組皮膚移植愈合率均高于對(duì)照組，以上結(jié)果提示：復(fù)方ANBP可以促進(jìn)小鼠皮膚移植愈合。

HE結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植14 d，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植交界處更加平坦連接緊密，皮膚移植區(qū)表皮層變薄趨于正常皮膚組織且出現(xiàn)較多新生毛囊，提示復(fù)方ANBP有利于皮膚移植皮片與周圍皮膚銜接，加速皮膚移植愈合。皮膚移植21 d，實(shí)驗(yàn)組皮膚移植交界處皮膚結(jié)構(gòu)緊密，皮層變薄，有收縮趨勢(shì)，皮膚移植區(qū)大量毛囊發(fā)育成熟、形成皮脂腺、立毛肌等皮膚附屬器官，膠原排列疏松有序，表明復(fù)方ANBP利于皮膚移植皮膚結(jié)構(gòu)趨于成熟、功能逐漸完善，提高愈合質(zhì)量。此外，我們推測(cè)復(fù)方ANBP在皮膚移植愈合后期可能具有促進(jìn)創(chuàng)面收縮、降低纖維化的作用，這種作用應(yīng)用于人體創(chuàng)傷面修復(fù)過(guò)程中可能具有抑制瘢痕的效果。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠背部全層皮膚原位自體移植模型，觀察比較創(chuàng)面愈合情況，運(yùn)用復(fù)方ANBP加速皮膚移植皮片與周圍皮膚的銜接、促進(jìn)毛囊等皮膚附屬器的發(fā)育和成熟，提高愈合質(zhì)量，但復(fù)方ANBP對(duì)小鼠皮膚移植創(chuàng)面愈合的治療機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（本文編輯? 蘇? 維）