蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥抑制II型糖尿病腎病小鼠微炎癥的研究

鋼更 郭瑞敏 薩如拉 溫都蘇畢力格 梅榮 白黑小 張全

摘 要：目的：探討蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥對(duì)II型糖尿病腎病小鼠微炎癥的抑制及腎功能改善.方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、II型糖尿病腎病模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組，通過(guò)檢測(cè)尿微量白蛋白和熒光探針標(biāo)記技術(shù)觀察各組動(dòng)物腎小球?yàn)V過(guò)率情況，制備病理組織切片HE染色觀察動(dòng)物組織病理結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)用透射電鏡技術(shù)觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變.結(jié)果：60mg/kg蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥可顯著提高II型糖尿病腎病小鼠的腎小球?yàn)V過(guò)率，修復(fù)腎小球基底膜功能，抑制腎間質(zhì)纖維化，抑制腎小管上皮細(xì)胞足細(xì)胞廣泛融合或丟失，降低電子致密物堆積.結(jié)論：蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥可有效抑制II型糖尿病腎病小鼠微炎癥.

關(guān)鍵詞：II型糖尿病腎病;蒙醫(yī)蒜變劑瀉藥;微炎癥

中圖分類號(hào)：R291.2;R781.6+4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）05-0030-05

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD），是1型和2型糖尿?。═1DM和T2DM）患者的一種嚴(yán)重并發(fā)癥[1].糖尿病的流行已達(dá)到流行病的程度，并在全球范圍內(nèi)繼續(xù)迅速增加，預(yù)計(jì)到2040年這一數(shù)字將上升到6.42億.雖然T1DM和T2DM的患病率都在增加，但最顯著的增加是在T2DM患者中.糖尿病對(duì)健康有實(shí)質(zhì)性的影響，并且個(gè)人和社會(huì)要為此承受巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]，雖然一些現(xiàn)有的治療干預(yù)可以延遲糖尿病腎病的發(fā)病和進(jìn)展，但糖尿病腎病的發(fā)病率仍然很高，需要新的治療方法.

DN特征是血壓逐漸升高，腎小球?yàn)V過(guò)率下降，為高風(fēng)險(xiǎn)心血管事件[3].DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜.持續(xù)性蛋白尿是糖尿病腎病的標(biāo)志，故其傳統(tǒng)診斷上以微量蛋白尿?yàn)榛A(chǔ)[1].腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）是腎功能評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)，用于確定腎臟疾病的進(jìn)展和藥物誘導(dǎo)的腎臟毒性.評(píng)估GFR最常用的方法之一是測(cè)量血液中被標(biāo)記菊粉的消失速率;由于菊粉在腎臟腎小球中被完全過(guò)濾（既不分泌也不被小管吸收），所以其消失率與GFR成正比.DN的病理變化主要有：腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多，腎小球基底膜（glomerular basement membranes，GBM）增厚，彌漫性或結(jié)節(jié)性硬化，細(xì)動(dòng)脈較明顯玻璃樣變性，部分病例標(biāo)本在毛細(xì)血管壁有細(xì)線狀I(lǐng)gG沉積，腎小管較突出的病理變化是上皮細(xì)胞泡沫狀改變.透射電鏡超微結(jié)構(gòu)病變特點(diǎn)有：GBM不同程度均質(zhì)性增厚，系膜基質(zhì)增多，可見(jiàn)足突細(xì)胞融合，無(wú)電子致密物沉積和細(xì)胞增生性改變[4，5]，當(dāng)機(jī)體發(fā)生腎小球腎炎時(shí)常常伴有電子致密物沉積和細(xì)胞增生性改變[6].

經(jīng)典蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥以大蒜、金柯子、肉蔻、紅花、巴豆、冰片、牛奶等組成的制劑，取后以水煎、過(guò)濾、濃縮而成.在臨床上治療腎病綜合征局灶性病變、微小病變型腎病有著確切療效[7，8].本研究試圖探討該藥劑對(duì)小鼠II型糖尿病腎病的治療效果，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步研究.

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)買7-8周齡雄性35只小鼠，其中db/m小鼠5只，II型糖尿病db/db小鼠30只（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部）.將小鼠飼養(yǎng)于溫度22～25℃、濕度65%的飼養(yǎng)室內(nèi)，晝夜輪替交換光照12h.

1.2 藥物及試劑

藥物成分：蒙醫(yī)“蒜變劑瀉藥”是以大蒜、金柯子、肉蔻、紅花、巴豆、冰片、牛奶等組成.制作方法，水煎、過(guò)濾、濃縮至2.5g/mL，裝入瓶中待用.

實(shí)驗(yàn)試劑：熒光探針GFR-Vivo 680（PerkinElmer，NEV30000），4%多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），2.5%戊二醛固定液（SPI，100703），蘇木素伊紅染色液（雷根生物，DH0006），812包埋劑（SPI，90529-77-4）.

1.3 主要儀器

活體近紅外光學(xué)成像系統(tǒng)（SWIR 1.0），全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司，7020），脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JJ-12），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）普通光學(xué)顯微鏡（Leica，NikonEclipseTi-SR），超薄切片機(jī)（Leica，UC7），鉆石切片刀（Daitome，Ultra 45°），透射電子顯微鏡（FEI公司，TECNAI G 20 TWIN）.

2 方法

2.1 模型建立

在動(dòng)物房適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，用0.6%戊巴比妥鈉按照10ml/kg劑量按體重進(jìn)行腹腔注射麻醉，去除背部毛發(fā)，小鼠俯臥，綁定小鼠四肢，用75%酒精涂抹裸露皮膚處后，涂碘伏消毒，找出腎的大約位置，切開(kāi)皮膚及肌肉層約1cm，翻開(kāi)腎周脂肪，找出左側(cè)腎動(dòng)脈和靜脈及輸尿管進(jìn)行結(jié)扎，然后切除腎臟，依次縫合肌肉層和皮膚，再次消毒，將小鼠放入籠子，待清醒，術(shù)后將小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后3d內(nèi)每天腹腔注射抗生素預(yù)防感染.

2.2 藥物干預(yù)

糖尿病腎病小鼠模型建立成功后，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、II型糖尿病組、II型糖尿病腎病組、強(qiáng)的松組、蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥低劑量組（L），蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥中劑量組（M），蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥高劑量組（H），強(qiáng)的松組、蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥組（L），蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥組（M），蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥組（H）分別給予30mg/kg強(qiáng)的松、30mg/kg蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥、60mg/kg蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥、90mg/kg蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥，正常對(duì)照組、II型糖尿病組和II型糖尿病腎病組分別灌胃給予等量的生理鹽水，每組5只，每天固定時(shí)間灌胃一次，連續(xù)給藥7天.

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 尿微量白蛋白（mAlb）檢測(cè)

分別于干預(yù)第3、6天將鼠放入小鼠代謝籠，收集動(dòng)物尿液，用比色法測(cè)定小鼠24h尿微量白蛋白.

2.3.2 腎小球?yàn)V過(guò)率檢測(cè)

每組小鼠連續(xù)給藥7d后，尾靜注射2nmol熒光探針GFR-Vivo 680（溶于100μL無(wú)菌PBS中），45min后于活體近紅外光學(xué)成像系統(tǒng)680nm熒光波長(zhǎng)下檢測(cè)信號(hào)，觀察并比較不同處理組熒光變化情況.

2.3.3 HE染色觀察病理變化

取腎臟組織，4%多聚甲醛固定48h，水洗過(guò)夜，梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4μm厚的石蠟切片，行HE染色，用光學(xué)顯微鏡在20倍物鏡下觀察拍照.

2.3.4 透射電鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化

將切好的腎臟組織置于2.5%的戊二醛固定液中4℃過(guò)夜，再用1%鋨酸磷酸緩沖液室溫固定2h，梯度酒精脫水，依次經(jīng)丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂（2：1）、丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂（1：1）、環(huán)氧樹(shù)脂滲透，37℃溫箱內(nèi)，每次滲透8～12小時(shí)，之后用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，60℃溫箱中聚合48小時(shí)，超薄切片機(jī)切片80nm厚，鈾鉛雙染色，室溫干燥，電鏡下觀察、拍照.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0對(duì)變量型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)bonferroni校正，事后檢驗(yàn)，進(jìn)行兩兩多重比較，顯著水平α=0.05，置信區(qū)間為95%，當(dāng)分析結(jié)果P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

4 結(jié)果

4.1 mAlb變化

各組動(dòng)物mAlb結(jié)果如表1所示.與正常組比較，DN組的mAlb明顯升高，且差異具有顯著性（P =0.0001）;高劑量組與DN組比較，mAlb明顯降低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）.

4.2 GFR變化

各組動(dòng)物GFR變化情況如圖1所示.正常組和T2DM小鼠腎小球?yàn)V過(guò)功能完全正常，而DN組GFR卻顯著下降，陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)的松組較DN組改善顯著，蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥低劑量組效果較差，中劑量組所有緩解，高劑量組效果最好.說(shuō)明該藥物可以修復(fù)腎小球基底膜，改善腎小球滲透濾過(guò)功能.

4.3 病理組織形態(tài)變化

各組動(dòng)物腎臟病理結(jié)構(gòu)變化如圖2所示.與正常組比較，T2DM組腎小管可見(jiàn)明顯擴(kuò)張，明顯管狀緣脫落，部分腎小球可見(jiàn)明顯萎縮壞死，組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);DN組腎小管可見(jiàn)明顯擴(kuò)張及明顯管狀緣脫落，組織可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);強(qiáng)的松組腎小管可見(jiàn)輕微擴(kuò)張，明顯管狀緣脫落，腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，部分腎小球可見(jiàn)明顯萎縮，組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);高劑量組腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯脫落水腫壞死，腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)腎小球明顯腫脹萎縮，組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn).由此可見(jiàn)，蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥對(duì)DN有顯著的病理改善作用.

4.4 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化

各組小鼠腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化如圖2所示.正常組腎小球整體結(jié)構(gòu)正常，GBM系膜未見(jiàn)明顯增厚，臟層上皮細(xì)胞足突排列整齊，未見(jiàn)彌漫性融合，系膜區(qū)未見(jiàn)明顯電子致密物沉積.與正常組比較，TADM組GBM可見(jiàn)少量電子致密物堆積，組織可見(jiàn)系膜細(xì)胞，足細(xì)胞明顯異常增生.DN組腎小球整體結(jié)構(gòu)異常，臟層上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器排列紊亂，可見(jiàn)大量線粒體脊斷裂，GBM可見(jiàn)明顯增厚，足突可見(jiàn)彌漫性融合，GBM可見(jiàn)明顯電子致密物沉積.強(qiáng)的松組腎小球整體結(jié)構(gòu)基本正常，GBM系膜未見(jiàn)明顯增厚，臟層上皮細(xì)胞足突排列較整齊數(shù)量較多，未見(jiàn)明顯融合，但基底膜可見(jiàn)明顯電子致密物堆積.高劑量組腎小球整體結(jié)構(gòu)基本正常，GBM系膜未見(jiàn)明顯增厚，臟層上皮細(xì)胞足突排列整齊，足細(xì)胞足突良好，未見(jiàn)彌漫性融合GBM可見(jiàn)明少量電子致密物沉積，而中劑量和低劑量組效果稍差.由此可見(jiàn)，該藥物不僅對(duì)腎病綜合征有良好效果，在炎癥抑制方面也有強(qiáng)大作用.

5 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約30-40%患者的糖尿病會(huì)發(fā)展為腎病.糖尿病腎?。―N）的發(fā)病原因非常復(fù)雜.DN是最常見(jiàn)的慢性腎臟疾病，是終末期腎臟疾病的主要病因.慢性糖尿病的發(fā)生與機(jī)體代謝及血流動(dòng)力學(xué)壓力等有關(guān)，這些壓力可促進(jìn)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的改變，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生功能障礙，從而促進(jìn)機(jī)體炎癥和纖維化的發(fā)生，導(dǎo)致各種類型的腎損傷.大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究證據(jù)表明，腎臟炎癥在糖尿病患者腎損傷進(jìn)展中具有決定性作用[9].

DN與全身性和局部性腎臟炎癥有關(guān).隨著疾病的發(fā)展，在早期糖尿病腎病患者機(jī)體血清或外周血中檢測(cè)到的炎性細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6，腫瘤壞死因子TNF-α，單核細(xì)胞趨化因子蛋白MCP-1，巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1β）和免疫調(diào)節(jié)因子（如粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，胞內(nèi)粘附因子ICAM-1，髓樣分化因子MyD88）水平顯著升高[10].此外，糖尿病患者腎活檢的組織學(xué)分析表明，糖尿病腎病是由三種腎小球病變構(gòu)成的：腎小球基底膜增厚、腎小球系膜擴(kuò)張和小動(dòng)脈玻璃樣變性[11].腎小球硬化的進(jìn)展是糖尿病腎病的主要組織學(xué)特征，其他組織學(xué)特征包括足細(xì)胞脫離腎小球基底膜、足細(xì)胞丟失、腎小球小管連接異常、腎小球數(shù)目減少、腎小球肥大、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，其中，足細(xì)胞丟失與2型糖尿病患者蛋白尿水平密切相關(guān)，腎小球數(shù)量降低和腎間質(zhì)纖維化與腎小球?yàn)V過(guò)率下降密切相關(guān)[9].腎活檢分析顯示，糖尿病腎病的腎小球和間質(zhì)均存在炎癥細(xì)胞，并與腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化相關(guān)[12，13].

DN是2型糖尿?。═2D）的主要并發(fā)癥，是決定糖尿病患者死亡率的關(guān)鍵因素.開(kāi)發(fā)既能控制T2D又能預(yù)防DN發(fā)展的新型治療藥物具有重要意義[14].民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)根植于各民族傳統(tǒng)文化土壤，幾千年來(lái)形成了豐富的診斷和醫(yī)療系統(tǒng)，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，具有獨(dú)特的醫(yī)藥理論體系.民族藥是中國(guó)民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，在我國(guó)少數(shù)民族地區(qū)甚至全國(guó)的現(xiàn)代醫(yī)療體系中發(fā)揮著重要作用[15，16].在蒙醫(yī)臨床用藥中發(fā)現(xiàn)，蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥對(duì)腎病相關(guān)疾病有著良好的預(yù)后和奇特功效.本文研究結(jié)果看出，糖尿病腎病小鼠口服90mg/kg蒙醫(yī)“蒜變劑”瀉藥，可以促進(jìn)腎小球基底膜修復(fù)，提升腎小球?yàn)V過(guò)率，降低尿液中微量白蛋白水平，抑制腎小球炎癥發(fā)生和腎間質(zhì)纖維化過(guò)程.初步判斷，該藥物是通過(guò)抑制機(jī)體腎臟炎癥來(lái)發(fā)揮其作用，但具體作用的蒙藥藥物成分和機(jī)理還不清楚，需進(jìn)一步深入研究探討.

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