rhtA和tyrP對谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響分析

顏文斌，張曉梅*，史勁松，許正宏

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(糧食與發(fā)酵國家工程實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

L-絲氨酸是化學(xué)和材料領(lǐng)域中最重要的30個骨架化合物之一，亦被廣泛運用于醫(yī)藥、化工、食品等多個領(lǐng)域[1-4]，也是世界氨基酸行業(yè)中工業(yè)化生產(chǎn)難度較大的氨基酸。目前，工業(yè)生產(chǎn)L-絲氨酸的方法主要有蛋白水解法[5]、化學(xué)合成法[6]和酶轉(zhuǎn)化法[7]等，其中蛋白水解法存在工藝復(fù)雜、分離精制困難等缺點；化學(xué)合成法存在污染重、D-絲氨酸與L-絲氨酸分離困難等缺點；酶轉(zhuǎn)化法是目前國際上普遍采用的方法，但仍存在轉(zhuǎn)化率偏低、前體物質(zhì)價格昂貴等問題。因此，以微生物利用廉價的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸正成為研究熱點[8]。

目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的研究主要集中于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌上。MUNDHADA等[9]將大腸桿菌Q1進行適應(yīng)性進化(ALE)，經(jīng)補料分批發(fā)酵，L-絲氨酸的產(chǎn)量達到37 g/L。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的重要菌株，目前對谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的研究集中于解除產(chǎn)物反饋抑制、增強合成途徑的表達及敲除降解途徑等代謝改造，L-絲氨酸在谷氨酸棒桿菌中的代謝涉及合成途徑3個關(guān)鍵酶和降解途徑2個關(guān)鍵酶，即甘油酸脫氫酶(PGDH，編碼基因serA)、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(PSAT，編碼基因serC)和磷酸絲氨酸磷酸化酶(PSP，編碼基因serB)；絲氨酸脫氫酶(SerDH，編碼基因sdaA)及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT，編碼基因glyA)。PETERS-WENDISCH等[10-11]以C.glutamicumATCC 13032作為出發(fā)菌株，敲除降解途徑的絲氨酸脫水酶編碼基因sdaA，解除反饋抑制并表達合成途徑關(guān)鍵酶基因serAΔ197、serC和serB，調(diào)控L-絲氨酸降解途徑關(guān)鍵酶絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達水平，構(gòu)建的重組菌L-絲氨酸的產(chǎn)量為36.26 g/L。本課題組[12]從自然界篩選得到1株能夠直接利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)6.65 g/LL-絲氨酸的菌株C.glutamicumSYPS-062，通過傳統(tǒng)誘變[13]、解除L-絲氨酸反饋抑制及敲除副產(chǎn)物代謝途徑，得到菌株ΔSSAAI，L-絲氨酸產(chǎn)量為26.23 g/L[14]，對菌株ΔSSAAI進行等離子誘變，得到突變菌株A36，L-絲氨酸產(chǎn)量達到30.57 g/L[15]。

雖然在代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-絲氨酸方面取得了一定進展，但還存在菌株高產(chǎn)機理不清晰，菌株發(fā)酵周期過長等問題，如能通過比較基因組分析初步解析谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)L-絲氨酸機制，則可為進一步理性改造L-絲氨酸高產(chǎn)菌株提供新的思路。本研究在對2株不同表型的產(chǎn)L-絲氨酸谷氨酸棒桿菌進行全基因組比較分析基礎(chǔ)上[15]，對其中與轉(zhuǎn)運或代謝相關(guān)的4個發(fā)生氨基酸突變的基因(folC、faS、rhtA和tyrP)進行研究，通過回復(fù)突變、基因敲除與加強表達，闡明這些基因與菌株產(chǎn)L-絲氨酸及生長之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物

產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI與其突變菌株A36為實驗室前期構(gòu)建并保藏；pK18mobsacB(縮寫pK18) 敲除質(zhì)粒為實驗室保藏[16]。大腸桿菌JM109為實驗室保藏，大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質(zhì)粒pDXW-10(縮寫pD)為江南大學(xué)王小元教授惠贈[17]。大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭誘導(dǎo)表達質(zhì)粒pZM1(縮寫pM)為美國倫斯勒理工學(xué)院Mattheos A.G.Koffas教授惠贈(doi.org/10.1186/s12934-018-0990-z)，引物詳細信息見表1，菌株與質(zhì)粒信息見表2。所用同源重組酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。限制性內(nèi)切酶EcoR I，XbaI，NdeI，BamH I和BglII購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)種子固體培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液(BHI)37，葡萄糖20，(NH4)2SO410，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20。

(2)種子液體培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液(BHI)37，葡萄糖20，(NH4)2SO410，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5；裝液量20 mL/250 mL。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer used in this study

注：下劃線代表同源臂

表2 菌株與質(zhì)粒Table 2 Strains and plasmids

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，(NH4)2SO430，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，原兒茶酸(PCA)0.03，生物素5×10-5，VB14.5×10-4；裝液量25 mL/250 mL，CaCO31.5 g/25 mL；

(4)谷氨酸棒桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，Tween-80 1，甘氨酸 25，異煙肼 0.04。

(5)蔗糖篩選培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液(BHI)37，蔗糖100，(NH4)2SO410，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

回復(fù)突變質(zhì)粒構(gòu)建：以rhtA基因回復(fù)突變?yōu)槔跃闍36的基因組為模板，選擇點突變前500 bp和后500 bp為擴增目標，利用引物rhtA-F、rhtA-R擴增含點突變的同源臂基因片段。通過單片段同源重組酶將含同源臂的目的片段與經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切的質(zhì)粒pK18mobsacB連接，構(gòu)建回復(fù)突變質(zhì)粒。

敲除重組質(zhì)粒的構(gòu)建：基因敲除也采用質(zhì)粒pK18mobsacB，以敲除基因tyrp為例，以ΔSSAAI的基因組為模板，分別利用pK-18-tyrp-1/2、pK-18-tyrp-3/4擴增tyrp的上下游同源臂片段，上下游同源片段與EcoR I和XbaI雙酶切的質(zhì)粒pK18mobsacB連接，得到敲除同源重組質(zhì)粒。

誘導(dǎo)型加強表達質(zhì)粒(IPTG誘導(dǎo))的構(gòu)建：以加強表達rhtA為例，以A36的基因組為模板，利用引物pZM1-r-F/R 擴增基因rhtA，目的基因rhtA采用單片段同源重組酶與經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切的線性化質(zhì)粒pZM1連接，得到誘導(dǎo)型加強表達重組質(zhì)粒。

組成型加強表達質(zhì)粒的構(gòu)建：以加強表達rhtA為例，以A36的基因組為模板，利用引物pDXW-10-r-F/R 擴增基因rhtA，目的基因rhtA采用單片段同源重組酶與經(jīng)EcoR I和BglII雙酶切的線性化質(zhì)粒pDXW-10連接，得到組成型加強表達重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組菌的構(gòu)建

回復(fù)突變菌株與敲除菌株的構(gòu)建：制備ΔSSAAI及A36感受態(tài)，將10 μL質(zhì)粒與100 μL感受態(tài)細胞混合加入電極杯中，在1.8 kV電壓下，5 ms電擊2次。將電擊的感受態(tài)細胞加入恢復(fù)液中放置于金屬浴(46 ℃)上溫育6 min，轉(zhuǎn)置于搖床上(120 r/min，30 ℃)溫育2 h，然后將其涂布電轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)基中(添加硫酸卡那霉素50 mg/L)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)，稀釋一定濃度涂布至100 g/L蔗糖篩選培養(yǎng)基上，進行二次同源重組篩選；挑取轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證及測序驗證。

誘導(dǎo)型加強表達與組成型加強表達菌株的構(gòu)建：將誘導(dǎo)型加強表達重組質(zhì)粒或組成型加強表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進行PCR驗證及測序驗證。

1.2.3 發(fā)酵方法

用接種環(huán)挑取1環(huán)菌落接種至種子液體培養(yǎng)基中(20 mL/250 mL)，于30 ℃，120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)，至對數(shù)生長期(生物量OD562=20～25)，按照體積分數(shù)為4%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中(25 mL/250 mL)，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始OD562≈1，于30 ℃，120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)120 h，每隔12 h取樣測定生物量及L-絲氨酸產(chǎn)量。

1.2.4 分析方法

生物量的測定: 采用1 mol/L的HCl稀釋發(fā)酵液至適當倍數(shù)，然后利用紫外分光光度計于562 nm處測定OD562作為菌體量。

L-絲氨酸的測定：利用HPLC測定樣品中的L-絲氨酸含量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因突變對菌株生長和產(chǎn)L-絲氨酸影響

在ΔSSAAI中利用pK18-faS、pK18-folC、pK18-rhtA、pK18-tyrP分別對faS、folC、rhtA和tyrP四個基因進行回復(fù)突變，基因片段大小如圖1所示，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M-Marker;1-rhtA PCR片段；2-tyrP PCR片段；3-folC PCR片段；4-faS PCR片段圖1 質(zhì)粒pK18-rhtA、pK18-tyrP、pK18-folC、pK18-faS電泳驗證Fig.1 Electrophoresis verification of pK18-rhtA, pK18-tyrP,pK18-folC, pK18-faS

利用上述重組質(zhì)粒經(jīng)二次同源重組分別構(gòu)建回復(fù)突變菌株Kf、Ko、Kr和Kt，再對菌株Kf、Ko、Kr和Kt中faS、folC、rhtA、tyrP基因分別進行測序，測序結(jié)果正確的表明回復(fù)突變菌株構(gòu)建成功。將回復(fù)突變菌株進行發(fā)酵，考察基因突變對菌株生長和產(chǎn)L-絲氨酸的影響，發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。

圖2 基因突變對ΔSSAAI生長和產(chǎn)L-絲氨酸的影響Fig.2 Effect of gene mutation on ΔSSAAI growth andL-serine production

從圖2可以看出，與出發(fā)菌株ΔSSAAI相比，4個突變株Kf、Ko、Kr和Kt的生物量均沒有顯著變化，突變菌株Kf、Ko的L-絲氨酸產(chǎn)量也沒有顯著變化；而突變菌株Kr、Kt的L-絲氨酸產(chǎn)量則有所提高，繼而對L-絲氨酸產(chǎn)量提高的2株菌Kr、Kt做發(fā)酵過程分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 出發(fā)菌株ΔSSAAI與回復(fù)突變菌株Kr、Kt生長過程曲線Fig.3 Growth curve of starting strain ΔSSAAI andreverse-mutant strains Kr, Kt

圖4 出發(fā)菌株ΔSSAAI與回復(fù)突變菌株Kr、Kt產(chǎn)L-絲氨酸過程曲線Fig.4 L-serine production curve of starting strainΔSSAAI and reverse-mutant strains Kr, Kt

從圖3可以看出，Kr、Kt的生長趨勢與出發(fā)菌株ΔSSAAI基本一致；從圖4可以看出，發(fā)酵前期，Kr、Kt的L-絲氨酸產(chǎn)量與出發(fā)菌株ΔSSAAI相比變化不明顯，而在發(fā)酵72 h后，2株突變株L-絲氨酸產(chǎn)量逐漸提高，最終突變菌株Kr、Kt的L-絲氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株ΔSSAAI分別提高18.5%和18.3%。說明rhtA與tyrP基因突變可能與菌株產(chǎn)L-絲氨酸相關(guān)。接下來采用分別敲除和加強表達rhtA與tyrP研究這2個基因?qū)晟L和產(chǎn)L-絲氨酸的影響。

2.2 rhtA、tyrP基因敲除對菌株生長和產(chǎn)L-絲氨酸的影響

采用1.2.1方法，利用pK18-R、pK18-T敲除質(zhì)粒在ΔSSAAI上分別敲除rhtA和tyrP兩個基因，敲除結(jié)果如圖5、圖6所示。圖5泳道2與泳道1相比缺失了約800 bp，圖6泳道2與泳道1相比缺失了約1 200 bp。表明基因rhtA和tyrP敲除菌株ΔrhtA與ΔtyrP構(gòu)建成功。敲除菌株ΔrhtA與ΔtyrP發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，與出發(fā)菌株ΔSSAAI相比，基因敲除重組菌ΔrhtA與ΔtyrP中L-絲氨酸產(chǎn)量無顯著變化。接下來通過加強表達rhtA與tyrP研究這2個基因?qū)晟L和產(chǎn)L-絲氨酸的影響。

M-Marker;1-以ΔSSAAI基因組為模板擴增rhtA基因片段;2-以敲除菌株基因組為模板擴增rhtA基因片段圖5 rhtA基因敲除電泳驗證Fig.5 rhtA gene knockout electrophoresis verification

M-Marker;1-以ΔSSAAI基因組為模板擴增tyrP基因片段;2-以敲除菌株基因組為模板擴增tyrP基因片段圖6 tyrP基因敲除電泳驗證Fig.6 tyrP knockout electrophoresis verification

圖7 rhtA、tyrP基因敲除對ΔSSAAI生長和產(chǎn)L-絲氨酸的影響Fig.7 Effect of rhtA, tyrP gene knockout onΔSSAAI growth and L-serine production

2.3 加強表達rhtA與tyrP基因?qū)晟L和產(chǎn)L-絲氨酸的影響

在出發(fā)菌株ΔSSAAI中加強表達rhtA和tyrP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-絲氨酸產(chǎn)量提高(結(jié)果未展示)；接下來在高產(chǎn)L-絲氨酸菌株A36上加強表達這2個基因，研究基因的功能。采用誘導(dǎo)型質(zhì)粒加強表達rhtA和tyrP得到重組菌株pM-R 和pM-T，考察加強表達rhtA與tyrP基因?qū)晟L和產(chǎn)L-絲氨酸的影響，分別在發(fā)酵24、36、48、60 h采用1 mmol IPTG誘導(dǎo)pM-R和pM-T表達，結(jié)果如圖8所示。

A36-對照菌株；pM-R、pM-R-24、pM-R-36、pM-R-48、pM-R-60-不加IPTG和24、36、48、60 h加IPTG；pM-T、pM-T-24、pM-T-36、pM-T-48、pM-T-60-不加IPTG和24、36、48、60 h加IPTG圖8 加強表達rhtA與tyrP對菌株生長和產(chǎn)L-絲氨酸的影響Fig.8 Effect of rhtA and tyrP overexpression onthe cell growth and L-serine production

從圖8可以看出，加入IPTG時間越早，對重組菌株的生物量影響越大，最終菌株生物量低于對照菌株A36，推測是IPTG對菌株生長產(chǎn)生抑制的結(jié)果。然后采用組成型質(zhì)粒構(gòu)建了加強表達rhtA與tyrP的重組菌株pD-R和pD-T，發(fā)酵120 h，菌株的最大生物量分別為39.1和34.3，比對照菌株A36分別下降13.88%和24.5% (圖9)，L-絲氨酸產(chǎn)量分別達到32.55和33.7 g/L，比對照菌株A36分別提高6.5%和10.3%(圖10)，單位菌體產(chǎn)酸量分別提高17.74%和38.9%。說明加強表達rhtA與tyrP有利于菌株產(chǎn)L-絲氨酸，但不利于菌株生長。

圖9 出發(fā)菌株與加強表達rhtA與tyrP菌株生長過程曲線Fig.9 Growth curve of starting strains and strainswith overexpression of rhtA and tyrP

圖10 出發(fā)菌株與加強表達rhtA與tyrP菌株產(chǎn)L-絲氨酸過程曲線Fig.10 L-serine production curve of starting strain andstrains with overexpression of rhtA and tyrP

3 討論與結(jié)論

本課題組前期對產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI進行ARTP誘變，得到1株生長與產(chǎn)L-絲氨酸均有提高的突變株A36。通過對ΔSSAAI 和A36進行全基因組測序以及比較基因組學(xué)分析，明確基因組遺傳變異與菌株生長及產(chǎn)L-絲氨酸之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株A36中有11個基因發(fā)生氨基酸突變[15]。首先對其中與轉(zhuǎn)運或代謝相關(guān)的4個差異基因進行研究，考察基因突變對ΔSSAAI產(chǎn)L-絲氨酸及生長的影響，結(jié)果表明，rhtA和tyrP的回復(fù)突變使得菌株ΔSSAAI產(chǎn)L-絲氨酸產(chǎn)量有提高，進一步采用基因敲除和加強表達研究rhtA和tyrP這2個基因?qū)晟L和產(chǎn)L-絲氨酸的影響。結(jié)果表明，敲除rhtA或tyrP，對菌株的生長和產(chǎn)L-絲氨酸并無明顯影響，而加強表達rhtA或tyrP則會導(dǎo)致產(chǎn)L-絲氨酸產(chǎn)量提高。繼而在高產(chǎn)L-絲氨酸菌株A36上驗證基因功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加強表達rhtA和tyrP的菌株L-絲氨酸積累量比A36分別提高6.47%和10.34%，但是加強表達rhtA和tyrP會影響菌株生長，尤其是在使用誘導(dǎo)型質(zhì)粒加強表達時，菌株生物量大幅下降，并呈現(xiàn)加入IPTG越早，重組菌株的最終生物量越小的趨勢，推測是菌株生長受到IPTG的抑制。研究結(jié)果表明，突變株A36中rhtA和tyrP基因突變有利于菌株產(chǎn)L-絲氨酸，敲除rhtA和tyrP對菌株產(chǎn)L-絲氨酸和生長影響不顯著，而加強rhtA與tyrP有利于谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸不利于菌株生長。

C.glutamicumATCC 13032全基因組測序及基因功能注釋工作的完成[18]，使得從基因組水平上解析谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)L-絲氨酸機制成為可能，同時也提供了一種新的分子育種方法。而基于全基因組突變分析的分子育種策略，則能夠從整個代謝網(wǎng)絡(luò)角度分析突變與表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有利突變或突變組合；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法的聯(lián)合使用，找到改造靶點，實現(xiàn)對菌株的理性代謝改造[19-22]。OHNISHI等[23]利用比較基因組學(xué)的方法，比較分析了高產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌和野生型菌株的基因組序列，鑒定到與L-賴氨酸積累相關(guān)基因的有益點突變；BECKER等[24]基于基因組學(xué)分析結(jié)果，以不產(chǎn)賴氨酸的野生型C.glutamicumATCC 13032為出發(fā)菌株，依次對12個相關(guān)基因靶點進行敲除增加基因拷貝數(shù)及更換啟動子等操作，使得重組菌株LYS12發(fā)酵30 h 賴氨酸產(chǎn)量即達到120 g/L。本課題組前期也曾對2株不同表型菌株做了全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶E1亞基編碼基因aceE的突變與重組菌的副產(chǎn)物增加直接相關(guān)[16]。而本研究發(fā)現(xiàn)，rhtA和tyrP對谷氨酸棒桿菌生長和產(chǎn)L-絲氨酸均有影響，文獻報道rhtA編碼內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白RhtA，參與大腸桿菌中蘇氨酸和高絲氨酸的外排[25]，tyrP編碼TyrP為酪氨酸特異性轉(zhuǎn)運蛋白，功能是將酪氨酸轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)[26]。從結(jié)果推測這2個基因編碼的蛋白也可能與L-絲氨酸轉(zhuǎn)運相關(guān)，加強表達rhtA和tyrP導(dǎo)致L-絲氨酸轉(zhuǎn)運出胞增多，L-絲氨酸產(chǎn)量提高，同時流向菌株生長的碳代謝流減少，菌株生長受到影響。今后將對rhtA和tyrP編碼的蛋白是否參與L-絲氨酸的轉(zhuǎn)運進行研究，以及對另外7個突變點進行詳細研究，明確基因型與表型之間的關(guān)系，為進一步理性設(shè)計改造L-絲氨酸高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。