液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定焙烤食品中多種防腐劑含量

李青,藍(lán)夢哲,宋光林,王大霞*,上官佳

1(廣電計(jì)量檢測(湖南)有限公司，湖南 長沙，410013) 2(廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東 廣州，510335) 3(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽，550002) 4(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙，410007)

防腐劑是指天然存在或合成的化學(xué)物質(zhì)，能夠有效地延遲微生物生長或化學(xué)變化引起的腐敗，主要作用于食品、藥品、顏料、生物標(biāo)本等物質(zhì)[1-6]。我國已批準(zhǔn)32種可使用的食物防腐劑，最常用的有苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸[7-16]。各種防腐劑都有其自身不同的特點(diǎn)：苯甲酸鈉的毒性較強(qiáng)，在相同的酸度值下抑菌效力僅為山梨酸鉀的1/3，因此許多國家逐漸用山梨酸鉀代替苯甲酸鈉，但是它價(jià)格低廉，在碳酸飲料和果汁飲料中依舊被廣泛使用；山梨酸鉀抗菌力強(qiáng)，主要用于醬油、醋、飲料、糕點(diǎn)及面包；脫氫乙酸及鈉鹽類主要對霉菌及酵母菌有較強(qiáng)的抑制作用，在糕點(diǎn)中的應(yīng)用較為廣泛；對羥基苯甲酸酯類對細(xì)菌酶系有抑制作用，主要作用于水果飲料；納他霉素對真菌有較強(qiáng)的破壞能力，可以高效地防止食物發(fā)霉，主要作用于果醬、飲料和香腸?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2016)規(guī)定，山梨酸、脫氫乙酸在糕點(diǎn)中的最大使用量分別為1.0、0.5 g/kg，糕點(diǎn)中納他霉素的表面殘留量不得超過10 mg/kg，苯甲酸、對羥基苯甲酸酯類不得在糕點(diǎn)、面包等焙烤食品中使用。

目前防腐劑檢測方法主要有：氣相色譜法[17-18]、液相色譜法[19-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]。前處理過程一般沿用萃取、離心、沉淀等經(jīng)典方法[25-27]。本實(shí)驗(yàn)主要對焙烤食品中防腐劑殘留量的檢測進(jìn)行研究，在進(jìn)行蛋白沉淀和油脂去除處理后，通過HLB固相萃取柱對樣液進(jìn)行凈化濃縮，提高檢測精度，利用液相色譜的分離能力、質(zhì)譜的高靈敏度，建立了一種可同時(shí)測定8種防腐劑的方法，既能滿足各防腐劑的檢出限和定量限要求，又能對各防腐劑混合使用量的計(jì)算提供便捷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、無水乙醇，均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

8種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品：苯甲酸、山梨酸、納他霉素、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

在市內(nèi)商場、小賣部、批發(fā)市場購買不同類型的面包、糕點(diǎn)、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點(diǎn)樣品，按照要求進(jìn)行樣品的制備。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB Seiex公司；ME 204E電子天平，瑞士梅特勒公司；TTL-DCⅡ氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；AS30600BT超聲振蕩儀，天津奧特賽恩斯儀器公司；SBEQ-LG固相萃取儀，上海爭巧科學(xué)儀器公司；H1850高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

分別取不同獨(dú)立包裝樣品3個以上，用四分法進(jìn)行樣品分割，然后用粉碎機(jī)充分粉碎并攪拌均勻，粉碎效果不理想的樣品用精制機(jī)進(jìn)一步粉碎。取其中200 g密封于4 ℃冰箱保存待測。

準(zhǔn)確稱取2 g樣品，加入10 mL正己烷后渦旋振蕩1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min后棄去正己烷，在殘留物中加入2 mL乙醇、2 mL亞鐵氰化鉀溶液、2 mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻后加入15 mL超純水，超聲提取30 min，12 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL容量瓶，加水定容至刻度。取5 mL樣品溶液加至已用甲醇和水活化的HLB固相萃取柱上，用5 mL甲醇洗滌HLB柱，收集全部流出液，50 ℃氮吹至近干，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液溶解殘留物，樣液過0.22 μm濾膜，取500 μL進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 溶液的配制

亞鐵氰化鉀溶液0.25 mol/L：稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液1.20 mol/L：稱取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸銨溶液(5 mmol/L)：稱取0.385 g乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.01 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用NaOH溶液(0.02 mol/L)溶解并用水定容，配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

苯甲酸、山梨酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取0.01 g的苯甲酸、山梨酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

苯甲酸、山梨酸混合中間工作液(10.00 μg/mL)：分別移取0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

脫氫乙酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合中間工作液(1.00 μg/mL)：分別移取0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取不同體積的混合中間工作液于10 mL容量瓶，用基質(zhì)空白溶液定容至刻度，配制成苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸為0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 μg/mL，納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的建立

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流動相A：5 mmoL/L乙酸銨溶液；流動相B：乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；流動相A的具體梯度洗脫條件：0～1 min，95%；1～3 min，95%～10%；3～6 min，10%；6～7 min，10%～95%；7～8 min，95%。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring)；氣簾氣壓力(curtain pressure)：30.0 (1 psi=6.895 kPa)；離子化電壓：正離子模式(ESI+)4 500 V，負(fù)離子模式(ESI-)-4 500 V；離子源溫度：550.0 ℃；噴霧氣：55.0 psi；輔助加熱氣：55.0 psi；Q1/Q3離子對、碰撞能量(collision energy)、去簇電壓(uncluster voltage)及離子模式見表1。

表1 八種防腐劑的Q1/Q3離子對、碰撞能量、去簇電壓及離子模式Table 1 Acids pairs, collision energy, declustering voltageand ion patterns of 8 preservatives

續(xù)表1

防腐劑母離子Q1子離子Q3去簇電壓碰撞能離子模式對羥基苯甲酸丙酯179.0179.092.0?136.0-50-50-33-20ESI-對羥基苯甲酸丁酯193.0193.092.0?136.0-160-60-28-25ESI-

注：*表示定量離子

儀器條件確定后，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，根據(jù)化合物的儀器響應(yīng)值，以3倍信噪比和10倍信噪比來確定物質(zhì)的檢出限和定量限。在檢出限和定量限確定后配制不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，根據(jù)線性關(guān)系擬合確定其線性范圍。

1.3.4 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限的確定

選擇月餅基質(zhì)空白溶液配制各物質(zhì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在穩(wěn)定的儀器條件下測定其線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析物峰面積對其濃度建立線性關(guān)系，通過回歸方程Y=a+bX及線性關(guān)系(R2)確定各物質(zhì)的線性范圍，根據(jù)各物質(zhì)線性范圍及限值確定各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。以各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檢測濃度進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測定20次，按信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，按信噪比S/N=10計(jì)算定量限。

1.3.5 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)各物質(zhì)的線性范圍及其在面包、糕點(diǎn)、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點(diǎn)樣品中的最大允許使用量，以月餅為基質(zhì)，選擇高、中、低3個不同層次的濃度進(jìn)行加標(biāo)，每個濃度平行測定3次進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，通過平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)來確定方法的準(zhǔn)確度是否滿足方法學(xué)的要求。

1.3.6 方法的實(shí)際應(yīng)用

在確立了各物質(zhì)的線性范圍、檢出限及定量限，并且方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驖M足方法學(xué)要求后，在市內(nèi)各商場、小賣部及批發(fā)市場隨機(jī)購買數(shù)量不等的面包、糕點(diǎn)、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點(diǎn)樣品，對樣品進(jìn)行均勻地粉碎制備。按照所建立的檢測方法進(jìn)行前處理及儀器測定，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確定

選擇乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨的流動相兩組組合進(jìn)行比對，主要考察各目標(biāo)物的分離度，同濃度下的響應(yīng)值，在以乙腈-乙酸銨溶液為流動相時(shí)，各目標(biāo)物的分離度比以甲醇-乙酸銨溶液為流動相時(shí)效果更好，最終選擇乙腈-乙酸銨溶液作為本方法的流動相，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 同濃度下不同流動相相應(yīng)值數(shù)據(jù)Table 2 Response data of different mobile phases at the same concentration

2.2 樣品前處理優(yōu)化

焙烤食品中蛋白質(zhì)對防腐劑項(xiàng)目的檢測具有較大的干擾作用。亞鐵氰化鉀和乙酸鋅組合溶液是常用去蛋白試劑，在去除油脂和蛋白后選擇HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化操作，凈化效果和回收率都能滿足要求，糕點(diǎn)樣品2.00 mg/kg濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，各物質(zhì)的回收率在81.3%～97.4%之間。

2.3 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

選擇月餅基質(zhì)空白溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析物峰面積對其濃度建立線性關(guān)系，得到線性方程和線性范圍，檢出限按信噪比S/N=3，定量限按信噪比S/N=10計(jì)算。在0.02～2.00 mg/kg范圍內(nèi)納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的線性關(guān)系良好，r2均在0.998以上，檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.04 mg/kg。在0.1～50.00 mg/kg范圍內(nèi)苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的線性關(guān)系良好，r2均在0.998以上，檢出限分別為0.1、0.05、0.01 mg/kg，定量限分別為0.4、0.2、0.04 mg/kg。

2.4 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

將8種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以高、中、低3個水平分別添加到面包、糕點(diǎn)、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點(diǎn)樣品中，按照本實(shí)驗(yàn)前處理和儀器條件進(jìn)行處理，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。每個濃度平行測定3次，平均回收率在80.1%～101.2%之間，RSD在1.1%～6.7%之間(表3)。

表3 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=3)Table 3 Experimental data on method accuracy

續(xù)表3

化合物添加質(zhì)量濃度/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%脫氫乙酸0.183.10.589.22.081.44.1對羥基苯甲酸甲酯0.190.20.594.32.098.64.2對羥基苯甲酸乙酯0.191.50.589.32.090.61.1對羥基苯甲酸丙酯0.189.40.5101.22.089.86.7對羥基苯甲酸丁酯0.187.00.588.22.097.35.6

2.5 樣品測定

從市場抽取112批次不同類型的樣品，按照本文前處理分別對面包、糕點(diǎn)、蛋糕、餅干、月餅、湘式擠壓糕點(diǎn)進(jìn)行檢測，其中湘式擠壓糕點(diǎn)作為質(zhì)控樣，試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明：在15批次月餅、10批次糕點(diǎn)、12批次湘式擠壓糕點(diǎn)中有脫氫乙酸檢出，15批次糕點(diǎn)、5批次湘式擠壓糕點(diǎn)、15批次月餅中有山梨酸檢出，3批次面包中有納他霉素檢出，對羥基苯甲酸酯類和苯甲酸在樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了同時(shí)測定焙烤食品中8種防腐劑的方法。樣品經(jīng)去除脂肪和蛋白質(zhì)后進(jìn)行HLB固相萃取柱的凈化，氮吹濃縮后經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行含量的測定。本方法可同時(shí)對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、納他霉素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的殘留量進(jìn)行檢測，各物質(zhì)在0.01～50 mg/kg的區(qū)間內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)在0.998 67～0.999 84，檢出限在0.01～0.1 mg/kg，定量限在0.04～0.4 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～

表4 樣品中防腐劑檢出數(shù)Table 4 Number of samples detected with preservatives

注：“-”表示未檢出

6.7%，均能滿足方法學(xué)的要求，也能夠滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2016。本方法測定的8種物質(zhì)均有防腐作用，對于監(jiān)測項(xiàng)目防腐劑混合使用時(shí)各自用量占其最大使用量的比例之和的檢測有著較大幫助，并且能夠?qū)Σ坏檬褂玫姆栏瘎┻M(jìn)行確證和定量。