幾種魚蛋白肽體外結(jié)合膽酸鹽的效果研究

關(guān)計蘭，張樂云，肖 鶯，楊 萍

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

據(jù)統(tǒng)計，近年來高血脂的發(fā)生率明顯呈上升趨勢[1]，且主要集中在中老年人群中出現(xiàn)[2]，高血脂能夠引發(fā)很多嚴(yán)重影響人體健康的病癥，如動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，并且高血脂的并發(fā)癥有高血壓和糖尿病，對人體健康危害極大[3]，在高血脂的預(yù)防和治療方面都應(yīng)引起重視，目前市面上流通的治療高血脂的化學(xué)類藥物因見效快而受到患者的青睞，但是這些藥物都會引起不同程度的副作用。近年來，具有輔助降血脂的功能性食品開發(fā)成為國內(nèi)外最熱門的領(lǐng)域之一。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合膽酸鹽的物質(zhì)，可以將膽汁酸排出體外，促使膽固醇不斷轉(zhuǎn)化為膽汁酸，以維持膽汁酸池的動態(tài)平衡，從而降低血液中膽固醇的含量[4]，從而起到降血脂的作用。魚蛋白肽作為一種生物活性物質(zhì)，可以由魚及其加工副產(chǎn)品酶解而得到，原材料種類眾多、資源充足。有關(guān)魚蛋白肽結(jié)合膽酸鹽效果的研究不多，江錕等人[5]發(fā)現(xiàn)，鱸魚蛋白酶解液在體外結(jié)合膽酸鹽的效果與酶解時間有關(guān)，酶解 5 h 時的酶解液的效果與處方降血脂藥物考來烯胺相當(dāng)；朱曉連等人[6]發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹魚肉胰蛋白酶解物對甘氨膽酸鈉體外結(jié)合率達到同濃度考來烯胺的48.3%。試驗比較了羅非魚肉肽、羅非魚皮肽、鰹魚肽的體外結(jié)合膽酸鹽的效果，以期為其進一步的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羅非魚肉肽A（羅非魚肉按照優(yōu)化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后濃縮噴霧干燥而得到）、羅非魚皮肽B（羅非魚皮按照優(yōu)化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后再經(jīng)截留限為1 kU 超濾所得的截留液濃縮、噴霧干燥而得到）、羅非魚皮肽C（羅非魚皮按照優(yōu)化的酶解工藝條件經(jīng)酶解、離心、微濾后再經(jīng)截留限為1 kU 的超濾所得的透過液濃縮、噴霧干燥而得到）、鰹魚肽D（去內(nèi)臟的鰹魚按照優(yōu)化的酶解工藝條件酶解、離心、微濾后再經(jīng)截留限為300 U 的納濾得到的截留液濃縮、噴霧干燥而得到））、鰹魚肽E（去內(nèi)臟的鰹魚按照優(yōu)化的酶解工藝條件經(jīng)酶解、離心、微濾后再經(jīng)截留限為300 U 的納濾得到的透過液濃縮、噴霧干燥而得到），分別由實驗室制備；膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉，美國Sigma 公司提供；考來烯胺，南京厚生藥物有限公司提供；福林酚試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；其他試劑均為分析純。

HHoS21-8-S 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；UV757CRT 型紫外可見分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品；FA1004 型精密電子分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Avanti J265 XP 型落地高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白質(zhì)含量測定

采用福林酚法，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.008X+0.005，R2=0.998。

1.2.2 膽酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考張婷婷等人[7]的試驗并稍作修改。精密稱取干燥至恒質(zhì)量的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，置于50mL 容量瓶中，加入蒸餾水溶解，并加至刻度，搖勻。精密吸取25 mL，置于另一個50 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度處，搖勻備用。吸取0.5 mg/mL 的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于具塞試管中，加入蒸餾水至2.5 mL，再加入約51.5%的硫酸7.5 mL，置于70 ℃水浴中加入20 min，然后取出冰浴5 min，于波長387.5 nm 處測吸光度（A），以吸光度A 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到吸光度與膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的線性方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到3 種膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線：膽酸鈉的線性回歸方程為Y=15.00X+0.114，R2=0.999；甘氨膽酸鈉的線性回歸方程為Y=17.96X+0.081，R2=0.998；牛磺膽酸鈉的線性回歸方程為Y=13.83X+0.064，R2=0.999。

1.2.3 魚蛋白肽結(jié)合膽酸鹽能力的測定

準(zhǔn)確稱取500 mg 的5 種不同魚蛋白肽和陽性對照考來烯胺置入錐形瓶，分別加入30 mL 質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的不同的膽酸鹽溶液，在37 ℃條件下水浴1 h，以蒸餾水為樣品空白，以膽酸鹽溶液為試劑空白。以轉(zhuǎn)速16 000 r/min 離心20 min，取上層清液，測定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中膽酸鹽的質(zhì)量濃度，分別計算魚蛋白肽對膽酸鹽的結(jié)合率和結(jié)合量。

式中：A1——樣品空白的吸光度；

A2——樣品結(jié)合膽酸鹽后的吸光度；

A3——試劑空白的吸光度；

V——膽酸鹽溶液/蒸餾水體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4 模擬胃腸道環(huán)境對魚蛋白肽結(jié)合膽酸鹽能力的影響

參考朱曉連等人[6]的試驗并稍作修改。取質(zhì)量濃度600 mg/mL 的羅非魚肉肽溶液2 mL 于25 mL 具塞試管中。加入2 mL HCl（濃度為0.01 mol/L），在37 ℃水浴中恒溫振蕩1 h（模擬胃環(huán)境）。隨后加入NaOH溶液（濃度為0.1 mol/L）調(diào)節(jié)pH 值至6.3。再加入10 mL 豬胰酶溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的模擬腸環(huán)境）和8 mL 配置好的膽酸鹽溶液（質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL），在37 ℃水浴下恒溫振蕩1 h。以磷酸鹽緩沖液作為樣品空白，以膽酸鹽溶液為試劑空白。將恒溫振蕩后的樣品轉(zhuǎn)入離心管，以轉(zhuǎn)速16 000 r/min 離心20 min。取上清液2.5 mL 于25 mL具塞試管中，加入硫酸7.5 mL，于70 ℃條件下水浴20 min。冰浴5 min 冷卻后，于波長387.5 nm 處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中膽酸鹽的濃度，分別計算結(jié)合率和結(jié)合量。

2 結(jié)果和分析

2.1 5種魚蛋白肽的可溶性蛋白質(zhì)含量

5 種魚蛋白肽的可溶性蛋白含量見表1。

表1 5 種魚蛋白肽的可溶性蛋白含量 / mg·g-1

由表1 可見，羅非魚皮肽C（<1 kU）的可溶性蛋白含量最高，羅非魚肉肽A、羅非魚皮肽B（>1 kU），鰹魚肽D（>300 U）、鰹魚肽E（<300 U）可溶性蛋白含量相仿且較低?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的高低與肽的水解度有關(guān)。

2.2 5種魚蛋白肽對3 種膽酸鹽的結(jié)合效果

5 種魚蛋白肽對膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響見表2。

由表2 可知，羅非魚肉肽A 對3 種膽酸鹽都有一定的結(jié)合能力，對?；悄懰徕c的結(jié)合率和結(jié)合量最高為38.27%和1.32 mg/g，其次是對甘氨膽酸鈉的為34.07%和1.04 mg/g，對膽酸鈉的最低為20.80%和0.82 mg/g；而羅非魚皮肽B（>1 kU）對3 種膽酸鹽都沒有結(jié)合效果；羅非魚皮肽C（<1 kU）對?；悄懰徕c有微弱的結(jié)合效果，結(jié)合率和結(jié)合量只有0.82%和0.03 mg/g；鰹魚肽D（>300 U）對3 種膽酸鹽都沒有結(jié)合效果；鰹魚肽E（<300 U）對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉都有結(jié)合效果，結(jié)合率和結(jié)合量分別為21.52%和0.74 mg/g，7.25%和0.22 mg/g?？傮w來說，沒有經(jīng)過分級分離的羅非魚肉肽、分子量較小的組分鰹魚肽E<300 U和羅非魚皮肽C<1 kU 具有一定的結(jié)合膽酸鹽能力，其中以羅非魚肉肽的效果最好。而考來烯胺對3 種膽酸鹽都有較高的結(jié)合率和結(jié)合量，對膽酸鈉的可達93.10%和3.67 mg/g，對?；悄懰徕c達97.18%和3.36 mg/g，對甘氨膽酸鈉達94.73%和2.88 mg/g。比較可知，羅非魚肉肽結(jié)合牛磺膽酸鈉的能力約為考來烯胺的40%。據(jù)報道牛磺膽酸鈉是屬于較難被結(jié)合的結(jié)合型膽酸鹽，容易結(jié)合牛磺膽酸鈉的物質(zhì)，對其他膽酸鹽也有結(jié)合能力。因此，選擇羅非魚肉肽進一步研究。

表2 5 種魚蛋白肽對膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響

2.3 羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結(jié)合的影響

羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響見表3。

表3 羅非魚肉肽用量對膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響

由表3 可知，從結(jié)合率看，羅非魚肉肽對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力均隨用量增加而增加的。從結(jié)合量看，羅非魚肉肽的添加量在超過500 mg 之后，對3 種膽酸鹽的結(jié)合能力都下降，所以無論是從結(jié)合率還是結(jié)合量來看，羅非魚肉肽用量在450～500 mg，即15.0～16.7 mg/mL 時，較為適宜。

2.4 模擬胃腸道環(huán)境對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鹽的影響

模擬胃腸道環(huán)境對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響見表4。

表4 模擬胃腸道環(huán)境對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鹽結(jié)合率和結(jié)合量的影響

由表4 可知，在模擬經(jīng)過人體的胃部消化、再到pH 值為6.3 小腸后，羅非魚肉肽對3 種膽酸鹽都有結(jié)合能力，但是與沒有模擬胃腸道環(huán)境的結(jié)果相比，羅非魚肉肽對膽酸鈉的結(jié)合能力明顯下降，結(jié)合率和結(jié)合量僅為2.46%和0.10 mg/g，而對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合率和結(jié)合量分別為43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，對比表3 可知，此時羅非魚肉肽對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力都提高了。

2.5 時間對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鈉的影響

時間對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鈉結(jié)合率和結(jié)合量的影響見表5。

表5 時間對羅非魚肉肽結(jié)合膽酸鈉結(jié)合率和結(jié)合量的影響

由表5 可知，羅非魚肉肽對膽酸鈉的結(jié)合率和結(jié)合量隨著時間的延長而增大，60 min 基本達到平衡，80 min 最大為31.15%和1.06 mg/g，而考來烯胺能夠迅速結(jié)合膽酸鈉，20 min 時結(jié)合率和結(jié)合量可達98.12%和3.45 mg/g，且基本達到平衡。

3 結(jié)論

通過研究羅非魚肉肽、羅非魚皮肽B（>1 kU）、羅非魚皮肽C（<1 kU）、鰹魚肽D（>300 U）、鰹魚肽E（<300 U）5 種魚蛋白肽對膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)羅非魚皮肽B、鰹魚肽D 對3 種膽酸鹽都沒有結(jié)合能力，羅非魚皮肽C對牛磺膽酸鈉、鰹魚肽E 對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉有較弱的結(jié)合能力，而羅非魚肉肽對3 種膽酸鹽都有一定的結(jié)合能力，其對?；悄懰徕c的結(jié)合率和結(jié)合量最高為38.27%和1.32 mg/g，對甘氨膽酸鈉的為34.07%和1.04 mg/g，對膽酸鈉的最低為20.80%和0.82 mg/g；羅非魚肉肽添加量為15.0～16.7 mg/mL時，結(jié)合膽酸鹽的能力較為適宜，模擬胃腸道環(huán)境實驗中發(fā)現(xiàn)羅非魚肉肽對?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉的結(jié)合率和結(jié)合量都提高，分別達到43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，對膽酸鈉的結(jié)合率和結(jié)合量降低為2.46%和0.10 mg/g，羅非魚肉肽在20 min 對膽酸鈉結(jié)合率和結(jié)合量可達12.93%和0.33 mg/g，60 min 基本達到平衡為28.74%和0.96 mg/g。陽性對照考來烯胺對3 種膽酸鹽都有較高的結(jié)合率和結(jié)合量，對膽酸鈉的可達93.10%和3.67mg/g，對牛磺膽酸鈉的達97.18%和3.36 mg/g，對甘氨膽酸鈉的達94.73%和2.88 mg/g。羅非魚肉肽結(jié)合?；悄懰徕c的能力約為考來烯胺的40%。結(jié)合5 種肽的可溶性蛋白含量可知，水解度會影響魚蛋白肽結(jié)合膽酸鹽的能力，但是蛋白種類是更為重要的影響因素，所以進一步開展對羅非魚肉肽的分級純化及理化性質(zhì)的研究很有必要。