雞bmp4過表達和敲除載體構(gòu)建及活性驗證

李婷婷， 孫長花，2， 周舒簡， 金 晶， 張亞妮， 左其生

(1. 揚州大學(xué) 江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室, 揚州 225009； 2. 揚州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院, 揚州 225009)

PGCs(Primordial germ cells)是所有生殖細胞的祖細胞，在種質(zhì)資源保護、組織工程治療等方面均有廣泛應(yīng)用。雞作為一種重要的模式動物，研究其生殖干細胞PGCs的起源、遷移等機制可為禽類物種保存、良種繁育等提供重要理論參考。研究表明骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)參與了哺乳動物胚胎的發(fā)育，調(diào)節(jié)未分化間充質(zhì)細胞的增殖和分化，在生殖細胞發(fā)育過程中，BMP4等信號調(diào)節(jié)生殖細胞分化為PGCs，啟動卵子或精子分化程序，最終形成配子[1-2]。而缺失bmp4的小鼠胚層發(fā)育有缺陷，不形成PGCs或尿囊基，最終在胚胎期死亡[3-5]。BMP4是生殖細胞發(fā)生分化形成配子的重要信號之一[6]，bmp4是BMP4信號通路上的關(guān)鍵基因，研究表明BMP4蛋白在不同物種中的保守性較高[7-8]。

本課題組前期通過添加BMP4蛋白初步建立了雞PGCs體外誘導(dǎo)模型[9]，證明bmp4基因能夠調(diào)節(jié)雞PGCs的形成，但是否與其在哺乳動物PGCs形成過程中的功能相同仍未知。因此，本研究構(gòu)建bmp4的過表達及敲除載體，為詳細研究bmp4在雞PGCs形成過程中的功能和機制，分析其在雞與哺乳動物PGCs形成過程中的差異，完善bmp4調(diào)節(jié)PGCs形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞胚成纖維細胞系DF-1和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體由本實驗室保存，LentiCas9-Blast、PGMLV-GM1載體由上海吉滿生物技術(shù)有限公司提供。PrimeSTAR Max DNA Polymerase、XbaI、EcoR I內(nèi)切酶購自TaKaRa，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone，胎牛血清購自Gibico，F(xiàn)uGENE?HD Transfection Reagen購自Promega，嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、TRIzol、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、熒光定量試劑盒和基因組提取試劑盒等購自北京天根生物技術(shù)有限公司，2×SoSoo同源重組酶、引物合成及測序等由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1bmp4過表達載體構(gòu)建

基于NCBI數(shù)據(jù)庫中雞bmp4 CDS區(qū)序列(NCBI登錄號：NM_205237)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計擴增引物，并添加同源臂，F(xiàn)：5′-tgttttgacctccatagaagatTCTAG AATGATTCCTGGTAACCGAATGCTGA-3′；R：5′-cgcggatccgatttaaattcGAATTCAGA GGAAGAGTCCAGCTAGAG CAAGC-3′(小寫字母為同源臂)，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。提取PGCs RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴增bmp4 CDS區(qū)全長。PCR擴增程序為：98 ℃ 預(yù)變性3 min；98 ℃ 變性25 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s， 35個循環(huán)； 72 ℃ 再延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收。同時利用限制性內(nèi)切酶XbaI、EcoR I切割pCDH-MV-MCS-EF1-copGFP空載體，并回收線性載體。利用同源重組法將目的片段連接到線性載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定后陽性菌株提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定正確的菌株送測序。測序正確后命名為pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

利用0.25%胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的DF-1細胞，1600 r/min離心6 min，棄上清。底部細胞用10%FBS-DMEM培養(yǎng)基重懸，以1.5×105個/孔密度鋪24孔板，細胞匯合度達70%時進行轉(zhuǎn)染。以pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP質(zhì)粒(μg)∶FuGENE(μL)=1∶3比例轉(zhuǎn)染細胞，24 h時觀察GFP熒光表達情況，48 h時收集細胞，TRIzol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。同時設(shè)計定量引物：bmp4-qF：5′-CGCTCTGCCCAAAGCCATGAACT-3′；bmp4-qR：5′-GCACGCTGCTGAGGTTGAAGACG-3′，RT-qPCR檢測bmp4的表達變化。

1.2.3bmp4敲除載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI上bmp4 CDS區(qū)序列，利用Guide Design Resources(https://zlab.bio/guide-design-resources)設(shè)計3個sgRNA敲除靶位點：sgRNA1 AAGAAAGTCGCAGAGCTTCA，sgRNA2 CCAAAGCCATGAACTCTTGC，sgRNA3 TGACGGCTGATTTGCTGGGC，分別合成寡聚單鏈DNA，退火后形成雙鏈。同時設(shè)置陰性對照sg-NC，序列為ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA。將雙鏈oligo分別連接到CRISPR/Cas9載體(PGMLV-GM1)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別命名為bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2、bmp4-sgRNA3。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后挑取若干個單菌株測序，陽性菌株提取質(zhì)粒送上海吉滿生物技術(shù)有限公司進行慢病毒包裹。

1.2.4bmp4敲除載體活性驗證

LentiCas9-Blast載體感染DF-1細胞(MOI=10)，并用殺稻瘟菌素(10 μg/mL)持續(xù)篩選2周，隨后感染sgRNA病毒載體(MOI=10)，嘌呤霉素篩選2周后收集細胞提取基因組，T7E1酶切試驗檢測敲除效率。在bmp4靶位點前后設(shè)計引物進行擴增，產(chǎn)物回收后進行T7E1酶切(體系為：10×T7E1 Buffer 1.1 μL，突變型DNA PCR產(chǎn)物400 ng，H2O補足10.5 μL)。酶切樣品放入盛有沸水的燒杯中，待其自然冷卻至室溫，加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃酶切30 min后立即加入1 μL DNA Loading Buffer混勻，65 ℃水浴10 min。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果；同時TA克隆試驗檢測敲除效率，以藥物篩選后的細胞基因組為模板擴增bmp4 CDS區(qū)，擴增產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)后每板挑取16株菌落送測序，根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計3個載體的敲除效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建bmp4過表達載體

為了構(gòu)建bmp4過表達載體，本研究根據(jù)其CDS區(qū)設(shè)計特異性擴增引物擴增全長。瓊脂糖凝膠電泳在1500 bp附近出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果，最佳擴增溫度為59 ℃(圖1-A)。在此條件下大量擴增目的條帶并連接到雙酶切后的線性載體上(圖1-B)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后菌液PCR鑒定和雙酶切結(jié)果顯示插入片段大小正確(圖1-C)。測序結(jié)果與擴增序列一致，說明bmp4過表達載體pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP構(gòu)建成功(圖1-D)。

A為bmp4 CDS區(qū)，M：DL5000 Marker， 1：60 ℃，2:59 ℃， 3：58 ℃，4：57 ℃； B為pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP載體；C為bmp4過表達載體雙酶切圖，M：DL5000 Marker，1：陰性對照(水)，2：重組質(zhì)粒；3：單酶切；4：雙酶切；D為bmp4過表達載體測序圖

圖1bmp4過表達載體構(gòu)建

Figure 1 Construction ofbmp4 overexpression vector

2.2 bmp4過表達載體在DF-1中的表達

為了驗證所構(gòu)建的pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP過表達載體是否能表達GFP蛋白，用測序正確的菌株提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞，48 h時觀察到綠色熒光(圖2-A)，說明轉(zhuǎn)染成功。收集細胞提RNA，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達載體后，bmp4表達量顯著高于轉(zhuǎn)染過表達空載體及空白對照組(P<0.01)，且空載與空白對照無顯著差異(圖2-B)。以上結(jié)果均說明構(gòu)建的bmp4過表達載體有活性，可啟動bmp4的表達。

A:bmp4過表達載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞(標尺100 μm)； B:定量檢測bmp4的表達(**表示P<0.01)

圖2bmp4過表達載體活性驗證

Figure 2 Validation ofbmp4 overexpression vector activity

2.3 靶向bmp4的sgRNA載體構(gòu)建

為了構(gòu)建bmp4敲除載體，利用Guide Design Resources(https://zlab.bio/guide-design-resources)在bmp4 CDS區(qū)設(shè)計3個sgRNA敲除靶點，構(gòu)建bmp4敲除載體bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3(圖3-A)，測序結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功(圖3-B)，送上海吉滿生物技術(shù)有限公司進行慢病毒包裹，載體滴度分別為1.16×109、5.23×108和1.07×109TU/mL。

2.4 bmp4敲除載體活性驗證

為了驗證3個sgRNA載體的敲除活性，將其轉(zhuǎn)染DF-1細胞，殺稻瘟菌素和嘌呤霉素各篩選2周(圖4-A)，收集細胞提取基因組做T7E1酶切檢測。酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，敲除組有兩條帶，野生型和空載組僅有一條帶(圖4-B)，說明3個sgRNA載體對bmp4均有敲除作用。同時，TA克隆測序結(jié)果進一步說明3個sgRNA載體對bmp4有敲除作用(圖4-D)，效率分別為6.25%、12.5%和18.75%，可見bmp4-sg3RNA敲除效率最高(圖4-C)，可用于后續(xù)試驗。

A:bmp4-sgRNA重組載體； B:從上到下分別為敲除載體sg1、sg2及sg3測序峰圖

圖3bmp4敲除載體構(gòu)建

Figure 3 Construction ofbmp4 knockout vector

A:敲除載體轉(zhuǎn)染DF-1藥物篩選后細胞形態(tài)圖(標尺100 μm)；B:T7E1酶切圖， M: 100 bp DNA Ladder， 1:sgRNA1， 2: sgRNA2， 3:野生型4:sgRNA3; C:從上到下分別為sg1、sg2、sg3載體TA克隆測序峰圖；D:sg1、sg2、sg3載體敲除結(jié)果及效率統(tǒng)計

圖4bmp4敲除載體體外活性驗證

Figure 4 The activity verification ofbmp4 knockout vectorinvitro

3 討論

Bmp4調(diào)節(jié)哺乳動物原始生殖細胞形成的研究已較為清楚，通過與靶細胞上的受體結(jié)合激活細胞內(nèi)SMADs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，將信號傳入細胞核進而調(diào)節(jié)PGCs的形成[10-11]，但其在雞PGCs形成中的作用仍不明確。目前市場上已有商品化的BMP4蛋白及其抑制劑，抑制劑主要是抑制BMP的I型受體(ALK2、ALK3、ALK6)及阻礙SMAD1/5/8的磷酸化，阻斷的效果與使用量有關(guān)[12]，用于體內(nèi)試驗時均有一定局限性，且不能直接作用于bmp4。因此，本實驗構(gòu)建了bmp4的過表達載體，轉(zhuǎn)染DF-1細胞后bmp4表達量顯著升高。同時構(gòu)建了bmp4的敲除載體，特異性靶向bmp4，在基因組上實現(xiàn)bmp4的敲除，徹底抑制其表達，阻斷bmp4的作用，便于bmp4功能及機制的探索。但敲除效率較低，使得轉(zhuǎn)染后陽性細胞的篩選和檢測工作較為困難。分析其原因，sgRNA和Cas9蛋白位于兩個載體上，需先轉(zhuǎn)染Cas9蛋白載體，殺稻瘟菌素篩選后再轉(zhuǎn)染sgRNA載體，較難保證細胞內(nèi)同時轉(zhuǎn)入了兩個載體。而且，經(jīng)過藥物篩選后細胞狀態(tài)變差，增加了sgRNA轉(zhuǎn)染的難度，導(dǎo)致本實驗最終敲除效率偏低。同時本實驗進行T7E1酶切和TA克隆檢測前僅進行藥物篩選未挑取單細胞株，可能混雜有部分bmp4未敲除的細胞，導(dǎo)致結(jié)果偏低。但基因組上已檢測到bmp4有敲除，因此，本研究中bmp4過表達及敲除載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)bmp4的功能及機制研究。

相對于利用RNA干擾技術(shù)及使用抑制劑降低基因的表達水平以研究基因功能而言，在基因組上進行敲除能更徹底地阻斷基因的表達，更準確地研究其功能?，F(xiàn)有的基因敲除技術(shù)主要有鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(CRISPR / Cas9)系統(tǒng)，其中CRISPR / Cas9技術(shù)相比于前兩者載體構(gòu)建簡單、工作量較小、成本低，且敲除效率高，已快速廣泛地應(yīng)用于動、植物基因編輯方面的研究[13-14]。近幾年利用CRISPR/Cas9技術(shù)對PGCs進行基因編輯的研究不斷深入[15-19]，已有文獻報道CRISPR/Cas9技術(shù)可應(yīng)用于家禽研究領(lǐng)域進行基因編輯[20-22]。但CRISPR/Cas9技術(shù)也存在一些缺點，如需要Cas9蛋白和sgRNA同時表達、脫靶效率較高等。現(xiàn)在CRISPR/Cas9敲除體系主要有Cas9蛋白和sgRNA位于同一個載體上及分別構(gòu)建到兩個載體上兩種形式。本實驗中Cas9蛋白和sgRNA分別在兩個載體上，降低了單質(zhì)粒表達系統(tǒng)脫靶率較高的問題。本研究在后續(xù)實驗中將繼續(xù)優(yōu)化載體及轉(zhuǎn)染條件，提高敲除效率，為后期bmp4功能驗證及具體分子機制解析奠定基礎(chǔ)。