CTAB反膠束體系合成己酸乙酯及氣相色譜法檢測(cè)

（威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264300）

己酸乙酯作為濃香型白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于釀酒行業(yè)[1].目前一般采用對(duì)甲苯磺酸或硫酸等化學(xué)法合成己酸乙酯[2].但化學(xué)法會(huì)產(chǎn)生很多缺點(diǎn)，比如有毒物質(zhì)殘留、副反應(yīng)多、后處理復(fù)雜、白酒質(zhì)量差等.而生物合成法合成短鏈酯已成為研究熱點(diǎn)[3-6].生物合成法有兩種：一種是微生物合成法，即利用反應(yīng)液中微生物細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化合成，其缺點(diǎn)是操作繁瑣、代謝產(chǎn)物復(fù)雜、產(chǎn)量小，無(wú)法滿足企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)的需要；另一種是酶合成法，優(yōu)點(diǎn)是酶因不溶于有機(jī)溶劑可反復(fù)使用、酶催化反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少.近年來(lái)，利用酶合成己酸乙酯迅速發(fā)展.1991年荷蘭某公司就推出了生物酯產(chǎn)品，批次生產(chǎn)規(guī)模相當(dāng)可觀[7].國(guó)內(nèi)關(guān)于脂肪酶催化合成酯也有相關(guān)報(bào)道，例如張艷等人用脂肪酶在非水相中催化合成己酸乙酯，最終用滴定法通過(guò)測(cè)定正己酸消耗量計(jì)算產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)90%以上[8].脂肪酶催化合成己酸乙酯多使用有機(jī)介質(zhì)，如正己烷或正庚烷溶劑[9]，酶催化己酸和無(wú)水乙醇合成己酸乙酯的無(wú)溶劑體系，產(chǎn)品后期處理更簡(jiǎn)單，環(huán)境污染較小，但因?yàn)榉磻?yīng)體系的極性較高，易造成酶蛋白變性而降低催化活性.[1]近年來(lái)，反膠束酶催化反應(yīng)成為新的研究熱點(diǎn)，反膠束是一種微乳液，其表面活性劑分子組成的膜將油水相隔開，模擬酶的天然環(huán)境，從而有利于保持酶的活性和穩(wěn)定性[10].因此利用反膠束酶催化合成己酸乙酯的方法簡(jiǎn)便、快捷、高效，會(huì)給企業(yè)帶來(lái)新的發(fā)展.

己酸乙酯作為一些白酒的重要特征指標(biāo)，它含量的高低在某種程度上標(biāo)志著酒質(zhì)量的好壞[11].目前檢測(cè)己酸乙酯的方法主要是酸堿滴定法測(cè)定轉(zhuǎn)化率.酸堿滴定法檢測(cè)誤差太大，步驟繁冗，檢測(cè)速度慢，且反膠束體系環(huán)境復(fù)雜，不利于檢測(cè)；同時(shí)，由于己酸為弱酸，盡管使用濃度極低的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，分析樣品中己酸含量很少且相差不明顯，導(dǎo)致滴定分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定性不好[12].而氣相色譜檢測(cè)法分離效率高，樣品用量少，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，可分離、分析恒沸混合物，沸點(diǎn)相近的物質(zhì).試驗(yàn)以陽(yáng)離子表面活性劑CTAB構(gòu)建反膠束體系催化合成己酸乙酯，建立氣相色譜外標(biāo)法檢測(cè)己酸乙酯的產(chǎn)量，為實(shí)際生產(chǎn)中己酸乙酯的檢測(cè)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶；己酸乙酯（色譜純）；正己酸（分析純）；三氯甲烷（分析純）；正丁醇（分析純）；異辛烷（分析純）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，分析純）；正己醇（化學(xué)純）；聚乙烯醇；磷酸（分析純）；橄欖油（化學(xué)純）；考馬斯亮蘭G250（分析純）；無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

SP6800 A氣相色譜儀（山東省南瑞虹化工儀器有限公司），CHA-S恒溫振蕩器（金壇市新航儀器廠），78-1型磁力攪拌器（江蘇常州國(guó)華儀器廠），DS-1高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠），98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司），DHP-9002型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），HH-8恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠），TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭飛鴿有限公司）.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酶CTAB反膠束體系的制備

以異辛烷：正己醇：酶溶液（體積比）為43∶6∶1配制反膠束體系，加入100 mmol/L的CTAB，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杌旌?，形成透明均一的澄清體系.

1.3.2 CTAB反膠束體系中脂肪酶催化反應(yīng)單因素反應(yīng)及正交試驗(yàn)

反應(yīng)條件：向上述反膠束體系中先加入己酸，再加入乙醇，置于恒溫振蕩器上，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，搖床轉(zhuǎn)速選為150 r/min[13].

單因素及正交試驗(yàn)：首先進(jìn)行反應(yīng)溫度、乙醇和己酸的物質(zhì)的量比、酶濃度、己酸濃度的單因素試驗(yàn)，然后進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn).反應(yīng)結(jié)束測(cè)定己酸的轉(zhuǎn)化率，并得出最佳試驗(yàn)條件.

1.3.3 己酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定：NaOH滴定法.

移取1 mL反應(yīng)液于50 mL錐形瓶中，加入10 mL 95%的酒精終止反應(yīng)，再滴加兩滴酚酞指示劑，用NaOH溶液滴定至微紅色，15 s不褪色為止，記下消耗的NaOH溶液體積V0.同時(shí)，取未反應(yīng)的混合液進(jìn)行空白試驗(yàn)，測(cè)得消耗的NaOH溶液體積V.

1.3.4 氣相色譜檢測(cè)方法的建立

1.3.4.1 氣相色譜分析條件

SE-30毛細(xì)管柱（15m×0.25mm，0.25 μm）；檢測(cè)器（采用GC-2010FID氫焰檢測(cè)器）溫度，180℃；汽化室溫度，140℃；柱溫，120℃；載氣，氮?dú)猓兌?9.99%）；分流比：不分流.

1.3.4.2 定量、定性方法

峰面積外標(biāo)法定量，出峰時(shí)間定性[14].

1.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍的確定[15]

對(duì)己酸乙酯色譜純標(biāo)樣進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為0.1～1.0 μL.以峰面積為橫坐標(biāo)，己酸乙酯標(biāo)樣含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.以峰面積（Y）為響應(yīng)值，與己酸乙酯標(biāo)樣含量（X）進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程[16].將供試品峰面積帶入回歸方程，計(jì)算己酸乙酯產(chǎn)物含量.

1.3.4.4 氣相色譜檢測(cè)方法的驗(yàn)證

精密度試驗(yàn)：用己酸乙酯色譜純標(biāo)樣進(jìn)樣0.2 μL，連續(xù)進(jìn)樣8次[17].根據(jù)峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

回收率試驗(yàn)：用己酸乙酯色譜純分別進(jìn)樣五組0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，每組進(jìn)樣3次做平行試驗(yàn).以己酸乙酯標(biāo)樣理論值為參比值，計(jì)算回收率.

1.3.5 氣相色譜檢測(cè)

將已處理的轉(zhuǎn)化液進(jìn)樣0.5 μL，再進(jìn)樣己酸乙酯標(biāo)樣（0.5 μL）和轉(zhuǎn)化液（0.5 μL）的混合物，根據(jù)二者峰的變化定性確定轉(zhuǎn)化液中己酸乙酯的峰的位置，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，已知峰面積，確定產(chǎn)物含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

添加質(zhì)量濃度為0.003 g/L的脂肪酶，己酸濃度為0.3 mol/L，己酸和乙醇的物質(zhì)的量比為1∶1，研究脂肪酶在不同溫度條件下，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下24 h時(shí)反應(yīng).結(jié)果見圖1.

由圖1可知，隨著溫度升高，己酸乙酯的轉(zhuǎn)化率先增加后下降，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，可見，脂肪酶在此溫度下活性最高，最有利于其催化反應(yīng)，超過(guò)該溫度，酶的活性下降，反應(yīng)速度下降，產(chǎn)物產(chǎn)量下降.因此單因素溫度結(jié)果為35℃.

2.1.2 己酸濃度對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

添加質(zhì)量濃度0.003 g/L的脂肪酶，己酸和乙醇的物質(zhì)的量比為1∶1，研究脂肪酶在不同己酸濃度，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下，35℃，24 h時(shí)反應(yīng).結(jié)果見圖2.

圖1 溫度對(duì)己酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 己酸濃度對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可知，隨著己酸濃度增加，己酸轉(zhuǎn)化率先增加后降低，當(dāng)己酸濃度為0.4 mol/L時(shí)，己酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高.分析可能的原因是，當(dāng)己酸濃度較低時(shí)，隨著濃度增加，反應(yīng)速度增加，產(chǎn)物產(chǎn)量增加，當(dāng)己酸濃度繼續(xù)增加后，可能是由于濃度高抑制了脂肪酶的活性，導(dǎo)致反應(yīng)速度降低，因而產(chǎn)物產(chǎn)量降低，即己酸轉(zhuǎn)化率降低.因此單因素己酸濃度選擇0.4 mol/L.

2.1.3 醇酸比對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

添加0.003 g/L的脂肪酶，己酸濃度為0.4 mol/L，研究脂肪酶在不同醇酸比（0.8∶1，0.9∶1，1∶1，1.1∶1，1.2∶1），搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下，35℃，24 h時(shí)反應(yīng).結(jié)果見圖3.

隨著醇酸比的增加，己酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì).分析可知，反應(yīng)初始由于乙醇濃度較低，體系中反應(yīng)速度慢，因此己酸轉(zhuǎn)化率較低，隨著乙醇濃度的增加，反應(yīng)速度加快，己酸轉(zhuǎn)化率升高；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加，乙醇濃度過(guò)高，剩余的乙醇抑制反應(yīng)，導(dǎo)致體系中反應(yīng)速度減緩，因而己酸轉(zhuǎn)化率隨之降低.

2.1.4 酶濃度對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

醇酸比為1∶1.1，己酸濃度為0.4 mol/L，研究脂肪酶在不同濃度下，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下，35℃，24 h時(shí)反應(yīng).結(jié)果見圖4.

圖3 醇酸物質(zhì)的量比對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 酶濃度對(duì)己酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知，隨著酶濃度的增加，己酸轉(zhuǎn)化率先增加后降低，在酶質(zhì)量濃度為0.003 g/L時(shí)之前，反應(yīng)速度增加，是由于反應(yīng)底物充足，隨著酶濃度增加，反應(yīng)速度也增加，產(chǎn)物產(chǎn)量增加.隨后，反應(yīng)速度緩慢，分析可能由于酶相當(dāng)于底物是充足的，反應(yīng)速度降低.因此單因素酶質(zhì)量濃度選擇0.003 g/L.

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

選取四因素三水平的正交試驗(yàn)表，確定每個(gè)因素的水平.然后按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)條件做兩個(gè)平行.反應(yīng)結(jié)束后取樣，終止反應(yīng)測(cè)定己酸轉(zhuǎn)化率.正交試驗(yàn)條件和結(jié)果如表1和表2所示.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

用SPSS軟件處理正交試驗(yàn)的結(jié)果，處理結(jié)果如表3所示.

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，4個(gè)變量對(duì)己酸乙酯的轉(zhuǎn)化率都有影響，分析表2可得，影響因素排序：B＞A＞C＞D，即酸濃度＞溫度＞醇酸比＞酶濃度，分析表3可知，最佳反應(yīng)條件為：A2B1C1D2，即反應(yīng)溫度為35℃，醇酸比為1∶1，酸濃度為0.03 mol/L，酶質(zhì)量濃度為0.003 g/L.

按照反應(yīng)的最佳條件，測(cè)定隨著時(shí)間變化，己酸轉(zhuǎn)化率變化，如圖5所示.

圖5 己酸轉(zhuǎn)化率圖

隨著反應(yīng)時(shí)間增加，己酸的轉(zhuǎn)化率呈增大趨勢(shì)，當(dāng)在第16 h，己酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，之后處于穩(wěn)定狀態(tài).因此本條件能夠在短時(shí)間內(nèi)使己酸達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率.

陳利梅等[18]研究了反膠束中黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯，并得出最優(yōu)條件和時(shí)間曲線.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸增加.但是隨后略有降低.與本實(shí)驗(yàn)相似，可能是由于隨著時(shí)間延長(zhǎng)，酶的活力降低造成的.

2.3 己酸乙酯色譜峰的確定

試驗(yàn)選取己酸乙酯色譜純進(jìn)樣，得出己酸乙酯色譜峰的位置，如圖6所示，2～3 min之間的峰1即為己酸乙酯.

圖6 氣相色譜檢測(cè)己酸乙酯標(biāo)樣譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍的確定[19]

對(duì)系列濃度為0.1～1.0 μL的己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以峰面積為橫坐標(biāo)，己酸乙酯標(biāo)樣含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性方程、相關(guān)系數(shù)，見圖7.

試驗(yàn)表明，R2＝0.990 9，說(shuō)明在0.1～1.0 μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于定量分析.

圖7 氣相色譜檢測(cè)己酸乙酯標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn)[20]

試驗(yàn)選取己酸乙酯標(biāo)樣0.2 μL，在本試驗(yàn)選定的條件下，進(jìn)行8次平行測(cè)定.精密度試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.98%.

結(jié)果表明該方法具有較好的重現(xiàn)性，是穩(wěn)定可靠的，能滿足檢測(cè)要求.

表4 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果 （n＝8）

用己酸乙酯色譜純分別進(jìn)樣五組0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，每組進(jìn)樣3次做平行試驗(yàn).測(cè)定結(jié)果如表5所示.

經(jīng)計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出該方法回收率在87.47%～95.76%，能滿足試驗(yàn)對(duì)準(zhǔn)確性的要求.并且隨著標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量的增加，方法回收率會(huì)相應(yīng)減小，可能是由于隨著進(jìn)樣量的增加，標(biāo)樣中的雜質(zhì)相應(yīng)增加或標(biāo)樣被污染.

2.7 反應(yīng)液中己酸乙酯峰定性，定量檢測(cè)[22]

試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)物時(shí)，進(jìn)樣后所得譜圖見圖8.根據(jù)己酸乙酯的峰位置，圖8中峰2為己酸乙酯，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線和轉(zhuǎn)化液中己酸乙酯的峰面積求出其含量.

試驗(yàn)表明，此方法可以較好的定性、定量測(cè)定轉(zhuǎn)化液中的己酸乙酯的含量.

表5 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖8 氣相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中的己酸乙酯譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用豬胰酶對(duì)反膠束體系中己酸乙酯進(jìn)行催化合成，采用正交試驗(yàn)得出最佳轉(zhuǎn)化條件為：溫度為35℃，酶質(zhì)量濃度為0.003 g/L，己酸濃度為0.3 mol/L，醇酸比為1∶1.隨后利用氣相色譜法檢測(cè)反膠束中合成的己酸乙酯，并對(duì)己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、回收率、精密度等方面進(jìn)行了分析研究.試驗(yàn)表明，己酸乙酯標(biāo)樣含量在0.1～1.0 μL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.990 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.98%，回收率在87.47%～95.76%范圍之間.結(jié)果表明該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，能夠達(dá)到檢測(cè)要求.試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法用于反膠束體系中脂肪酶催化合成己酸乙酯的定性和定量分析，結(jié)果比較滿意，能達(dá)到轉(zhuǎn)化液中己酸乙酯的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求.