HPLC同時測定廣地龍中5種核苷類成分含量

關水清，周改蓮,2,*，董婧婧，林青華，黃 盼，王 倩

(1.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001；2.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275；3.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 深圳 518049)

廣地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier ) 的干燥體，其味咸，性寒，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效[1-2]，臨床常用于治療高熱神昏、肢體麻木、半身不遂、高血壓等疾病[3-5]。廣地龍因個大、質佳成為地龍藥材市場的主流產品，主要產自廣東、廣西，為嶺南地區(qū)道地藥材[6-7]。目前藥材市場流通的地龍來源混亂，摻雜使假現(xiàn)象嚴重[8-10]，且現(xiàn)行的2015版《中國藥典》中地龍項下只有顯微鑒別和薄層鑒別，對其指標成分沒有明確規(guī)定，缺乏定量的評價方法[1]。為確保其安全有效地應用，根據(jù)國家對中藥材及中藥飲片標準化的要求及市場對廣地龍藥材需求量的增加,故有必要對廣地龍藥材質量進行評價。

現(xiàn)代研究表明[11-13]，廣地龍含有蛋白質、多肽、核苷酸、氨基酸以及脂肪酸等多種化學成分，其中以次黃嘌呤為代表的核苷類成分，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)、抗缺血性損傷、抗菌、抗血小板聚集等多種生物活性[14-15]，其與廣地龍舒張支氣管、抗組胺、平喘、調節(jié)免疫功能、調節(jié)血糖、抗缺血性損傷等藥理活性[16-18]具有一定的關聯(lián)性，可作為廣地龍藥材質量評價的指標。為此，本研究采用HPLC法同時測定廣地龍中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷5種核苷類成分的含量，以期為全面客觀地評價廣地龍藥材的質量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫)；Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(北京迪馬科技有限公司)；SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 藥材與試劑

廣地龍藥材分別于2018年采購于廣東、廣西，經暨南大學藥學院馬志國副教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier )的干燥體。藥材低溫干燥后粉碎成粗粉，過60目(相當于孔徑250 μm)篩，備用。具體見表1。

尿嘧啶(批號:wkq18013109，質量分數(shù)大于等于98%)、次黃嘌呤(批號:wkq16091402，質量分數(shù)大于等于98%)、尿苷(批號:wkq17100902，質量分數(shù)大于等于98%)、肌苷(批號:wkq17111309，質量分數(shù)大于等于98%)、鳥苷(批號:wkq17092012，質量分數(shù)大于等于98%)均購自四川維克奇生物科技有限公司；甲醇(色譜純，F(xiàn)esher公司)；水為自制純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(5∶95，體積比)等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量:10 μL。按上述色譜條件進行檢測，廣地龍中各成分分離度良好，對照品和供試品色譜圖見圖1、2。

表1 20批廣地龍樣品來源信息

1. 尿嘧啶， 2. 次黃嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鳥苷圖1 對照品色譜Fig. 1 HPLC chromatogram of standard sample

1. 尿嘧啶， 2. 次黃嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鳥苷圖2 供試品色譜Fig. 2 HPLC chromatogram of test sample

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷對照品適量，置100 mL量瓶中，加質量分數(shù)0.9%生理鹽水制成每1 mL分別含尿嘧啶7.42 μg、次黃嘌呤63.00 μg、尿苷31.80 μg、肌苷306.00 μg、鳥苷20.80 μg的混合對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定上述過篩后的廣地龍粉末約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入質量分數(shù)0.9%生理鹽水20 mL，密塞，搖勻，稱量；浸泡30 min后冰浴超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再次稱量，用生理鹽水補足減失的質量，取上清液離心15 min(13 000 r/min)，即得供試品溶液。

2.4 線性關系考察

精密吸取2.2節(jié)混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、15 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1節(jié)色譜條件測定。分別以對照品的量X(ng)為橫坐標，色譜峰峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程，具體結果見表2。

表2 廣地龍中5種核苷類成分線性考察結果

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)重復進樣測定6次，并分別計算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷和鳥苷峰面積的RSD(n=6)，RSD值分別為 0.39%、0.56%、0.45%、0.23%和0.52%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取1號樣品按2.3節(jié)供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.1節(jié)色譜條件進行檢測，根據(jù)峰面積計算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的RSD分別為2.36%、1.34%、1.01%、1.59%、1.33%，表明該方法的重復性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取1號樣品按2.3節(jié)制備供試品溶液，分別于0、4、6、8、10、12 h按2.1節(jié)色譜條件進行檢測，根據(jù)峰面積計算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的RSD分別為2.17%、1.73%、1.89%、0.82%、1.68%，表明廣地龍供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

精密稱定已知含量的1號廣地龍樣品9份，每份約1 g，分別精密加入低、中、高劑量的尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷對照品，按2.3節(jié)方法制備供試品溶液，按2.1節(jié)色譜方法進行檢測，計算表明尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷平均加樣回收率分別為99.27%、99.14%、98.59%、98.69%、99.91%，RSD分別為0.95%、0.86%、1.01%、0.86%、1.91%，表明方法的準確度較好。

2.9 樣品含量測定

取20批不同產地的廣地龍樣品，分別按2.3節(jié)方法制備樣品溶液，按2.1節(jié)方法進樣測定，分別計算各樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的含量，結果見表3。

表3 20批廣地龍樣品中核苷類成分含量測定結果

結果顯示，不同產地廣地龍中5種核苷類成分的含量差異很大，總含量最高為4號樣品(4.565 9 mg/g) ，最低為2號樣品(3.309 9 mg/g)，4、6、7、8、10、11、12、13、14、15、19、20號樣品中核苷類成分總含量較高，均超過了平均含量(4.210 4 mg/g)，其余樣品的總含量較少，與平均值相差較大。所有產地的廣地龍中均含有尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷這5種核苷類成分，平均含量由大到小依次為：肌苷(3.022 8 mg/g)、次黃嘌呤(0.602 1 mg/g)、尿苷(0.295 9 mg/g)、鳥苷(0.214 9 mg/g)、尿嘧啶(0.074 7 mg/g)，各產地廣地龍中肌苷的含量均較高，尿嘧啶含量均較低，說明廣地龍中5種核苷類成分含量差異較大。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

根據(jù)核苷類成分的理化特性[19-20]，分別考察不同提取方式(加熱回流提取、超聲提取)、不同提取溶劑(生理鹽水、純水、體積分數(shù)10%甲醇、體積分數(shù)10%乙醇)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80, g∶mL)和不同提取時間(30、60、90 min)對其提取量的影響。結果表明：①提取方式選擇：加熱回流提取和超聲提取對廣地龍的提取無顯著性差異(P>0.05)，但超聲提取法更加簡捷，故選擇超聲的提取方法，期間發(fā)現(xiàn)超聲時水溫會隨時間增長而升高，故以冰浴超聲方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴超聲，去除超聲過程中溫度帶來的影響；②最佳提取溶劑為生理鹽水；③最佳料液比為1∶10；④最佳提取時間為60 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

色譜柱考察：通過對ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、FNG-AQ C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)3種不同色譜柱進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)：①FNG-AQ C18色譜柱：尿嘧啶和次黃嘌呤色譜峰與樣品基質色譜峰重疊現(xiàn)象較嚴重，分離效果不好；②ZORBAX SB-C18色譜柱：尿嘧啶、次黃嘌呤及尿苷色譜峰與樣品基質色譜峰重疊現(xiàn)象較嚴重；③Diamonsil C18色譜柱：對供試品溶液各色譜峰的分離效果較好。綜合各色譜柱的色譜峰分離效果，最終選擇Diamonsil C18色譜柱。

流動相考察：在流動相的選擇過程中[21-25]，通過考察乙腈-水、甲醇-水、甲醇-體積分數(shù)0.1%甲酸溶液、甲醇-體積分數(shù)0.1%乙酸溶液和甲醇-體積分數(shù)0.1%磷酸溶液對峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當以甲醇-水(5∶95)作為流動相時，供試品溶液的峰形及分離效果最優(yōu)。

流速及柱溫考察：比較不同流速(0.6、0.8和1.0 mL/min)和不同柱溫(25、30和35 ℃)下各待測成分的分離度，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃下有較好的分離。

檢測波長考察：在波長選擇的過程中[21-25]，通過DAD全波長掃描，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在254 nm下各待測成分吸收值最大，因此選擇254 nm作為檢測波長。

總的來說，在色譜條件探索過程中發(fā)現(xiàn)，色譜峰峰形對流動相比例的變化較敏感，甲醇用量是一個較為敏感的因素，過大分離度不好，過小會影響色譜柱的使用壽命，但柱溫對分離度影響不大。

3.3 不同批次廣地龍中5種核苷類成分含量的差異

課題組通過實地調研、DNA鑒別，采購傳統(tǒng)道地產區(qū)廣東、廣西的廣地龍樣品，保障藥材來源的可靠性。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，運用HPLC法同時測定藥材中幾種化合物含量能高效地確定其含量[26-28]。因此，本研究采用HPLC法同時測定20個不同產地廣地龍中5種核苷類成分的含量，發(fā)現(xiàn)不同產地核苷類化合物含量差異較大，有些產地含有較高或者含有較低含量的特定核苷類化合物，這為廣地龍的產地確定和質量評價提供了新思路。

4 結論

本研究建立了高效液相色譜法同時測定廣地龍藥材中5種核苷類成分含量的方法，其色譜條件為：色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(5∶95，體積比)；流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，運行時間20 min。

本研究表明：該方法可用于不同產地廣地龍藥材5種核苷類成分含量的測定，對廣地龍質量控制研究有顯著意義。