Calreticulin在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

淋巴瘤是最常見的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，在中國常見惡性腫瘤死亡原因中居第10位［1］，其中B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）發(fā)病占淋巴瘤的90%以上，而NHL中最常見的亞型為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）。中國的DLBCL發(fā)病率占所有B細(xì)胞NHL的40%以上［2］，是成人最常見的B細(xì)胞NHL。DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣（germinal center B-cell，GCB）型和非生發(fā)中心B細(xì)胞樣（non-GCB）型。化療聯(lián)合利妥昔單抗可以改善臨床結(jié)局［3］。然而，1/3的患者會逐漸耐藥，變?yōu)殡y治性，對以往治療藥物甚至二線治療或基于免疫治療的三線治療無反應(yīng)［4］，這些患者預(yù)后往往較差。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）修訂版淋巴組織腫瘤分類［5］，將以往的介于Burkitt淋巴瘤與DLBCL形態(tài)之間的“灰區(qū)”淋巴瘤歸為高級別B細(xì)胞淋巴瘤，其中發(fā)生MYC、BCL-2和（或）BCL-6基因重排的高級別B細(xì)胞淋巴瘤劃分為新的獨立類型，稱為“雙打擊”或“三打擊”高級別B細(xì)胞淋巴瘤（double/triple hit lymphoma，DHL/THL），其發(fā)生率為6%～13%［6］。

鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin）相對分子質(zhì)量為46×103，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)主要的鈣結(jié)合蛋白之一［7］，其參與多個重要的細(xì)胞過程，主要包括鈣離子平衡調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊加工、基因表達(dá)調(diào)控、血管生成、細(xì)胞黏附、抗原呈遞、自身免疫等［8-9］，主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中。研究表明，calreticulin在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，如胃腺癌［10］、尿路上皮癌［11］、鱗狀細(xì)胞癌［12］、肺腺癌［13］、前列腺癌［14］等，在腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲等作用。但其在淋巴瘤中尤其是B細(xì)胞NHL中表達(dá)的臨床意義仍不明確。為了評估calreticulin的表達(dá)對DLBCL患者預(yù)后的影響，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測DLBCL腫瘤組織中calreticulin的表達(dá)情況，同時應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測腫瘤組織中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情況，旨在為臨床評估預(yù)后提供參考。

1 資料和方法

1.1 病例資料

收集2015—2018年于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院確診且臨床資料完整的143例DLBCL患者作為研究對象。標(biāo)本經(jīng)4%的甲醛溶液固定，之后進(jìn)行脫水及石蠟包埋，切片后進(jìn)行H-E染色。根據(jù)H-E切片，每例選定1個典型且均一的取樣位點制作組織芯片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測腫瘤組織中calreticulin的表達(dá)情況，同時應(yīng)用FISH技術(shù)檢測腫瘤組織中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情況，進(jìn)一步結(jié)合臨床資料進(jìn)行回顧性分析。由2名獨立的經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師讀片證實H-E染色、免疫組織化學(xué)染色及FISH結(jié)果。所有DLBCL均依據(jù)WHO 2008年診斷標(biāo)準(zhǔn)和2016年修訂標(biāo)準(zhǔn)［5］確診，并應(yīng)用Hans法則分為GCB型和non-GCB型。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（B2018-073R），所有患者和（或）家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)

將制作好的組織芯片切片后，進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。Calreticulin抗體購自美國Proteintech Group公司。CD20、CD3、PAX-5、BCL-6、BCL-2、CD10和Ki-67等淋巴瘤常用一抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。應(yīng)用羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的BenchMark XT全自動免疫組織化學(xué)染色儀進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判定：calreticulin為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜著色，＞75%的細(xì)胞無著色為0分，＞75%的細(xì)胞淺黃著色為1分，＞75%的細(xì)胞黃色著色為2分，＞75%的細(xì)胞棕黃著色為3分。定義0～1分為calreticulin陰性表達(dá)，定義2～3分為calreticulin陽性表達(dá)。

1.3 FISH

石蠟切片脫蠟后放入82 ℃蒸餾水中預(yù)處理25～30 min，之后于37 ℃胃蛋白酶（美國Sigma公司）溶液中消化后梯度乙醇脫水、風(fēng)干。所用探針均購自美國Abbott公司（Vysis BCL-2 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis BCL-6 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis MYC Break Apart FISH Probe Kit）。應(yīng)用美國Abbott公司的Thermo Brite雜交儀按探針說明書提供的方法進(jìn)行操作。在日本Olympus公司BX5l型熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)分離探針屬性，紅綠信號分離為陽性信號。結(jié)果判定：正常細(xì)胞顯示2個紅色、2個綠色信號，當(dāng)紅綠信號之間分離超過2個點寬度時判為異常細(xì)胞，異常細(xì)胞比例超過閾值，就判斷患者為基因重排陽性。每個標(biāo)本由3名實驗員分別計數(shù)，取其平均值。本實驗室MYC、BCL-2、BCL-6基因重排陽性細(xì)胞閾值均為15%。本課題研究對象為非DHL/THL的DLBCL病例。

1.4 隨訪

對所有患者隨訪5～57個月，隨訪以門診或電話方式進(jìn)行，隨訪內(nèi)容包括患者生活質(zhì)量、一般情況、近期復(fù)查情況等。終點事件為患者因DLBCL死亡。觀察記錄每例隨訪患者的生存時間，總生存期（overall survival，OS）指自病理學(xué)確診至因任何原因死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，DLBCL中calreticulin的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系行Pearsonχ2檢驗，若理論頻數(shù)1≤T＜5，采用χ2檢驗的連續(xù)校正公式，若理論頻數(shù)T＜1，采用χ2檢驗的Fisher精確概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析。應(yīng)用COX比例風(fēng)險模型分析影響DLBCL患者預(yù)后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Calreticulin在DLBCL患者腫瘤組織中的表達(dá)

Calreticulin的表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。Calreticulin代表性免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果見圖1。143例DLBCL患者中，calreticulin不表達(dá)的病例為12例（8.4%），1分病例40例（28.0%），2分病例43例（30.1%），3分病例48例（33.6%）。本研究0～1分定義為calreticulin陰性，2～3分定義為calreticulin陽性，143例DLBCL患者中，calreticulin陽性表達(dá)者92例，陽性表達(dá)率為64.3%。

2.2 Calreticulin表達(dá)水平與DLBCL病例臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

Calreticulin表達(dá)情況與DLBCL患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系見表1。經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期的病例在calreticulin陽性組所占比例（38.0%）高于calreticulin陰性組（17.6%）（P=0.011）。國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分0～1分的病例在calreticulin陽性組中所占比例（34.8%）高于calreticulin陰性組（11.8%）（P=0.013）。DLBCL患者calreticulin表達(dá)陽性組及calreticulin表達(dá)陰性組的年齡、性別、Hans分型、MYC重排、BCL-2重排及BCL-6重排等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 DLBCL患者腫瘤組織中calreticulin的代表性免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Representative immunohistochemical staining of calreticulin in tumor tissues of DLBCL patients

2.3 DLBCL組織中calreticulin表達(dá)與生存期的關(guān)系

對本研究143例DLBCL患者隨訪5～57個月。在隨訪結(jié)束時，calreticulin陽性組92例患者中，24例因疾病死亡，68例至隨訪結(jié)束仍生存；Calreticulin陰性組51例患者中，5例因疾病死亡，46例至隨訪結(jié)束仍生存。Calreticulin陽性組死亡患者的比例（26.1%）明顯高于calreticulin陰性組（9.8%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.381，P=0.020）。Kaplan-Meier生存曲線見圖2，calreticulin陽性表達(dá)組較陰性表達(dá)組生存期短（χ2=5.285，P=0.022）。應(yīng)用Hans法則將所有

DLBCL患者分為GCB型和non-GCB型后發(fā)現(xiàn)，在GCB亞型中，calreticulin陽性表達(dá)患者較陰性表達(dá)患者OS顯著縮短（P=0.023），而在non-GCB亞型中，calreticulin陽性表達(dá)患者OS與陰性表達(dá)患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.307，圖3）。

表1 Calreticulin表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between calreticulin expression and clinicopathological characteristics of patients with DLBCL

圖2 Calreticulin蛋白表達(dá)對DLBCL患者OS的影響Fig.2 The influences of calreticulin protein expression on the OS of DLBCL patients

2.4 影響DLBCL患者預(yù)后因素的單因素及多因素分析

單因素及多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡是否大于60歲及calreticulin表達(dá)是影響DLBCL患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05，表2）。

通過對年齡、是否GCB亞型、Ann Arbor臨床分期及IPI分?jǐn)?shù)這些影響淋巴瘤患者預(yù)后的因素進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)在年齡大于60歲（HR=3.163，95% CI：1.186～8.437）、Ann Arbor分期為Ⅲ～Ⅳ期（HR=3.456，95% CI：1.296～9.215）、IPI分?jǐn)?shù)3～5分（HR=4.188，95% CI：1.407～12.468）的患者中calreticulin陽性表達(dá)提示DLBCL患者預(yù)后較差（表3）。

圖3 Calreticulin表達(dá)對GCB與non-GCB亞型DLBCL患者OS的影響Fig.3 The influences of calreticulin expression on the OS in patients with GCB and non-GCB subtype DLBCL

表2 影響DLBCL患者預(yù)后的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analyses of clinicopathologic characteristics affecting the prognosis of DLBCL patients

表3 對calreticulin表達(dá)和DLBCL患者的生存進(jìn)行分層分析Tab.3 Stratified analysis for calreticulin expression and DLBCL patients’ survival

3 討 論

DLBCL患者的預(yù)后隨著治療方案的優(yōu)化已經(jīng)取得了明顯的改善，但仍有約1/3的患者最終死于耐藥或疾病復(fù)發(fā)［15］，其耐藥的具體分子機制目前尚不明確。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，研究影響DLBCL預(yù)后的因素有助于對不同患者制定更具有針對性的精準(zhǔn)治療方案。目前有研究表明，發(fā)生MYC、BCL-2和（或）BCL-6基因重排的DHL/THL預(yù)后較差，不管臨床上給予任何治療方案，其中位生存期僅2～18個月［16-17］。MYC基因定位于染色體8q24上，長期以來一直被認(rèn)為是真正的癌基因。正常情況下MYC表達(dá)量很低且具有誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡的能力，但其可能通過基因突變、基因擴增和染色體易位等機制而不受調(diào)控地過度表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化［18］，在腫瘤細(xì)胞增殖和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。多項研究證實，在利妥昔單抗時代，發(fā)生MYC基因重排的DLBCL患者治療反應(yīng)差，容易復(fù)發(fā)及進(jìn)展［20-24］。當(dāng)然，也有一些研究指出，發(fā)生MYC、BCL-2重排的雙打擊淋巴瘤患者預(yù)后差主要是因為BCL-2重排［25］。BCL-2是抗凋亡的原癌基因，位于染色體18q21上，編碼抗凋亡蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)生染色體（14；18）（q32；q21）易位后，會導(dǎo)致BCL-2與IGH基因融合，使BCL-2蛋白異常高表達(dá)。已知BCL-2在多種腫瘤中呈高表達(dá)，并且與耐藥相關(guān)［26］。有研究［27］發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者中，MYC基因易位發(fā)生率約為14%，BCL-2基因易位發(fā)生率約為21%，而BCL-6基因易位發(fā)生率約為31%。本研究中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位發(fā)生率分別為8.4%、8.4%和25.2%，略低于文獻(xiàn)報道的水平，可能與人群的地區(qū)差異及樣本量有關(guān)。

Calreticulin是高度保守、普遍存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的鈣結(jié)合蛋白，隨著近年來研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)calreticulin的生物功能不僅局限在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而是涉及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激、鈣離子平衡調(diào)節(jié)等多種生理和病理生理過程的多功能蛋白［28］。已發(fā)現(xiàn)calreticulin存在于除酵母以外的所有細(xì)胞當(dāng)中，主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中。目前已發(fā)現(xiàn)calreticulin在多種惡性腫瘤中的表達(dá)增加，且與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，calreticulin以依賴MEK/ERK通路的方式上調(diào)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［29］。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的calreticulin表達(dá)較癌旁組織明顯增加［30］。Calreticulin還可通過激活STAT5A通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及侵襲［12］。在膀胱尿路上皮癌中calreticulin的表達(dá)量也有所增加，calreticulin表達(dá)的下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長與遷移能力，而其過表達(dá)可增強細(xì)胞的遷移和附著能力［11］。在結(jié)腸癌中calreticulin呈高表達(dá)，這種高表達(dá)尤其表現(xiàn)在惡性程度高和分化較低的區(qū)域腫瘤細(xì)胞中［31］。在淋巴造血系統(tǒng)中，calreticulin的作用也越來越受到研究者的重視。有研究［32］顯示，沉默calreticulin的表達(dá)后，NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力受到抑制，提示calreticulin在腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲中具有重要作用。另有研究［33］發(fā)現(xiàn)，70%～84%的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）患者存在calreticulin基因突變，且calreticulin基因突變與JAK2和MPL突變是相互排斥的。而在其他髓系腫瘤中，如急性髓系白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征中未見calreticulin基因突變。但calreticulin基因突變與calreticulin高表達(dá)之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

本研究的143例DLBCL患者中，calreticulin陽性表達(dá)者92例，陽性表達(dá)率為64.3%。Kaplan-Meier生存曲線顯示，calreticulin陽性表達(dá)組較陰性表達(dá)組生存期短（χ2=5.285，P=0.022）。應(yīng)用Hans法則將所有DLBCL患者分為GCB型和non-GCB型后發(fā)現(xiàn)，在GCB亞型中，calreticulin陽性表達(dá)患者較陰性表達(dá)患者O S 顯著縮短（P=0.023），而在non-GCB亞型中，calreticulin陽性表達(dá)患者OS與陰性表達(dá)患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.307），在non-GCB亞型中，calreticulin陽性與陰性的患者生存差異無統(tǒng)計學(xué)意義可能與non-GCB亞型預(yù)后較差有關(guān)，non-GCB患者中大部分為激活B細(xì)胞樣（activated B cell-like，ABC）型。多項研究顯示，ABC型的DLBCL患者比GCB型患者預(yù)后差［22，34］。本研究還發(fā)現(xiàn)，MYC重排陽性在calreticulin陽性組中所占比例明顯高于陰性組，而ABC及GCB型在BCL-2、BCL-6、MYC等基因的重排率、信號通路的活化、基因突變等方面都不盡相同，可能與calreticulin表達(dá)在non-GCB亞型中無明顯差異有關(guān)，需要今后進(jìn)一步的研究證實。進(jìn)一步進(jìn)行單因素及多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡是否大于60歲及calreticulin表達(dá)是影響DLBCL預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），分層分析發(fā)現(xiàn)，在年齡大于60歲（HR=3.163，95% CI：1.186～8.437）、Ann Arbor分期為Ⅲ～Ⅳ期（HR=3.456，95% CI：1.296～9.215）、IPI分?jǐn)?shù)3～5分（HR=4.188，95%CI：1.407～12.468）的患者中calreticulin陽性表達(dá)提示DLBCL患者預(yù)后較差，提示calreticulin高表達(dá)與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)。綜上所述，DLBCL中calreticulin陽性表達(dá)的患者生存率低，可能與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力增加有關(guān)，calreticulin的表達(dá)對DLBCL預(yù)后評估具有一定參考價值。