彌漫大B細胞淋巴瘤中NF-κB/p65、PD-1、PD-L1表達相關性研究及其蛋白表達的臨床意義

貴州醫(yī)科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是B細胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最常見的亞型，盡管R-CHOP、DA-EPOCH-R等方案治療有效，仍有30%以上的患者復發(fā)或轉變成難治性淋巴瘤［1］。目前認為核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路激活是DLBCL的重要發(fā)病機制，其中NF-κB扮演著關鍵角色，尤其是活化細胞來源彌漫大B細胞淋巴瘤（activated B-cell like-DLBCL，ABC-DLBCL）［2-3］；程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）及其配體（programmed cell death ligand-1，PDL1）與腫瘤細胞免疫“逃逸”相關，臨床資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)DLBCL患者若高表達PD-1、PD-L1其生存預后均較差［4-6］。多項體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌、T細胞淋巴瘤中NF-κB的激活能促進或調節(jié)PD-L1的表達［7-9］。目前，在DLBCL中NF-κB通路與PD-1/PD-L1通路是否存在“串話”（crosstalk）尚未見報道；因此，本研究收集DLBCL患者隨訪數(shù)據(jù)和臨床病理學資料，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）、普通免疫組織化學及免疫組織化學雙標記染色檢測患者蠟塊組織中相關mRNA和蛋白水平，初步分析其與患者臨床病理學參數(shù)之間的關系及生存預后的價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

回顧性收集貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科2010年1月1日—2017年12月31日DLBCL患者的組織蠟塊及其臨床數(shù)據(jù)；選取直徑大于0.5 cm、組織豐富且明確診斷為DLBCL的90例蠟塊進行實驗。

1.2 主要試劑

一抗（均為單克隆抗體）PD-1、PD-L1和NF-κB/p65購自美國Abcam公司；一抗Pax5，二抗試劑盒（PV-9001、PV-9102）及顯色劑（DAB和AP-Red）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。R N A 提取試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司；SYBR Green熒光染料、反轉錄試劑盒、內參均購自寶生物工程（大連）有限公司；PD-1、PD-L1引物購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 PV二步法檢測p65、PD-1蛋白并根據(jù)p65結果分組

蠟塊切片4 μm厚，脫蠟、水化、修復抗原（EDTA pH為8.0），按試劑盒進行一抗溫育過夜（p65和PD-1分別以1∶2 000、1∶300稀釋）；DAB顯色后進行判斷，以扁桃體組織作為陽性對照，陰性對照以PBS（pH為7.35）替代一抗。

1.3.1 p65判讀

腫瘤細胞的細胞質或細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為蛋白表達，據(jù)參考文獻［10］采用陽性細胞所占比例及染色強度評分（腫瘤陽性細胞占比：無細胞陽性為0分，＜10%陽性為1分，10%～40%陽性為2分，＞40%陽性為3分；染色強度：無染色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分），最終得分為二者的乘積，定義得分0～4分為p65低表達組，6～9分為高表達組。

1.3.2 PD-1判讀

PD-1表達于腫瘤組織的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）細胞核，該部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為蛋白表達，采用計量方法，隨機選擇10個不重復400倍視野，每個視野隨機計數(shù)400個細胞，統(tǒng)計陽性細胞比例，取所有視野的平均值作為該例表達率，并取所有病例表達率的均數(shù)為“截斷值”（cutoff值），大于或等于該閾值定義為PD-1陽性，否則為陰性［11］。

1.4 免疫組織化學雙標記染色檢測PD-L1的表達

同1.3方法DAB顯色PD-L1蛋白后，再以EDTA（pH為9.0）修復，按SAP-9102試劑盒步驟用AP-Red顯色劑檢測Pax5蛋白，透明封片后進行圖像采集并分析。PD-L1、Pax5陽性對照分別為乳腺癌組織、扁桃體組織，陰性對照以TBS（pH為7.35）替代一抗，以TBS作為緩沖液及沖洗液。

細胞膜呈棕黃色且細胞核呈紅色為腫瘤細胞PD-L1蛋白表達，細胞膜呈棕黃色但細胞核未呈紅色為腫瘤微環(huán)境細胞PD-L1（PD-L1 of tumor microenvironment cells，mPD-L1）（即TIL的PDL1）蛋白表達；采用同PD-1一樣的計量方法，統(tǒng)計PD-L1在腫瘤細胞或在微環(huán)境細胞上的表達率；定義腫瘤細胞表達率≥截斷值為PD-L1陽性［11］；另外在PD-L1陰性的DLBCL病例中，若PD-L1于微環(huán)境細胞（即TIL）表達率≥20%，定義為mPD-L1陽性［12］。

1.5 RNA提取、反轉錄、RTFQ-PCR檢測

RNA提取、反轉錄：取8 μm組織進行脫蠟、蛋白酶消化處理，據(jù)RNA提取試劑盒步驟提取RNA，并用DEPC水溶解RNA，DEPC于核酸定量儀調零后，檢測RNA濃度及純度，取D值（D260nm/D280nm）在1.8～2.0的樣本往下進行實驗。按寶生物工程（大連）有限公司RR47A試劑說明，先進行去除基因組DNA（42 ℃2 min），于冰上配置反轉錄體系后進行反轉錄（37 ℃ 30 min，再加熱至85 ℃ 5 s），緩慢冷卻分裝后于-80 ℃冰箱保存。

RTFQ-PCR反應：分p65蛋白高表達組和低表達組配置反應體系，據(jù)寶生物工程（大連）有限公司RR820A試劑盒說明，取cDNA樣本于冰上配置SYBR Green RTFQ-PCR反應體系，PD-1上游引物為5’-GCGTGACTTCCACATGAGC-3’，下游引物為5’-GCAGGCTCTCTTTGATCTGC-3’；PD-L1上游引物為5’-CTATGGTG GTGCCGACTACA-3’，下游引物為5’-TGC TTGTCCAGATGACTTCG-3’，各組中每個樣本設置復孔3個（先配置總反應體系，再分裝3個復孔）；以β-actin（上游引物為5’-TAGTTGCG TTACACCCTTTCTTG-3’，下游引物為5’-TCA CCCTTCACCGTTCCAAGTTT-3’）作為內參，于Bio-Rad CFX connect RTFQ-PCR儀上進行反應（反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃5 s，退火/延伸為60 ℃ 30 s，重復50個循環(huán)），以2-ΔΔCt值為mRNA相對表達量計算［13］（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt組內最低值）。

1.6 統(tǒng)計學處理

SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計運算；計數(shù)資料組間差異性比較用四格表卡方檢驗；相關性分析用Spearman秩相關；組間mRNA均值差異比較采用t檢驗，且正態(tài)分布用表示，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)（lg10）轉化為正態(tài)分布后用（10lgχ±10lgS）表示；生存分析采用Kaplan-Meier曲線表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

DLBCL共90例，年齡17～82歲（中位年齡58.5歲），其中男性47例，女性43例；據(jù)Hans分型，14例為GCB型，76例為non-GCB型，＜60歲48例，≥60歲42例，Ⅰ+Ⅱ期49例，Ⅲ+Ⅳ期41例，25例有B癥狀，國際預后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分0～2分組、3～5分組分別為51例、39例，51例檢查血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），42例檢查β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）。

2.2 p65蛋白高表達與PD-1、PD-L1蛋白的相關性

如表1所示，90例樣本中p65高表達占61.11%（55/90），PD-1陽性率為32.22%（29/90），腫瘤細胞PD-L1陽性率為24.44%（22/90），mPD-L1陽性率為28.89%（26/90)；p65高表達與PD-1蛋白表達無相關性（γ=0.160，P=0.132）；但p65高表達與腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境細胞表達PD-L1蛋白相關（γ=0.242，γ=0.295；P=0.022，P=0.015）。H-E染色、p65、PD-1、PD-L1蛋白表達見圖1。

表1 90例DLBCL患者中p65蛋白表達與PD-1、PD-L1蛋白的相關性Tab.1 The correlation between p65 protein and PD-1,PD-L1 proteins in 90 DLBCL patients

圖1 DLBCL的H-E染色和免疫組織化學染色結果Fig.1 Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical results of DLBCL

2.3 腫瘤細胞PD-1表達與mPD-L1表達的關系

腫瘤組織浸潤T細胞表達PD-1與腫瘤細胞表達PD-L1顯著相關（γ=0.272，P=0.010），但腫瘤組織浸潤T細胞表達PD-1與微環(huán)境細胞（即TIL）表達PD-L1無相關性（γ=0.035，P=0.777，表2）。

表2 90例DLBCL患者中PD-1蛋白與PD-L1蛋白相關性Tab.2 The correlation between PD-1 protein and PD-L1 protein in 90 DLBCL patients

2.4 PD-1、PD-L1相對mRNA表達量在不同p65蛋白量組間比較

采用RTFQ-PCR檢測PD-1、PD-L1的mRNA，經(jīng)統(tǒng)計PD-1 mRNA相對表達量均值在P65蛋白低表達組（0.974 0±0.545 5）與高表達組均值（1.084 3±0.499 8）相比差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.985，P=0.327）；但PD-L1 mRNA相對表達量均值在P65蛋白低表達組（1.1520±0.537 9）與高表達組（1.525 9±0.844 6）間差異有統(tǒng)計學意義，且高表達組相對較高（t=-2.566，P=0.012，表3）。

表3 不同P65蛋白表達量組別中PD-1、PD-L1 mRNA相對表達量比較Tab.3 Comparison of relative mRNA expression levels of PD-1 and PD-L1 in different groups of P65 protein content

2.5 p65、PD-1、PD-L1、mPD-L1蛋白表達與臨床病理學特征的關系

p65蛋白表達在不同性別、年齡、Ann Arbor分期、B癥狀、IPI評分、LDH、β2-MG組中差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但在不同Hans分型組中存在差異，且non-GCB組表達率相對較高（P=0.007）；PD-1表達在不同性別、年齡、Hans分型、Ann Arbor分期、B癥狀、LDH、β2-MG組中差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但PD-1蛋白表達在不同的IPI評分組中差異有統(tǒng)計學意義，且3～5分組陽性率相對較高（P=0.044）；腫瘤細胞表達PD-L1蛋白在不同性別、年齡、Hans分型、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG組中差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但在不同IPI評分、B癥狀組中差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007，P=0.001），即若腫瘤細胞表達PDL1，患者IPI評分較高且易出現(xiàn)B癥狀；此外，腫瘤微環(huán)境細胞（即TIL）表達PD-L1蛋白在以上不同組別中差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4～5），臨床資料見2.1。

2.6 p65、PD-1、PD-L1、mPD-L1蛋白表達與患者的生存分析

在90例DLBCL患者中，患者存活36例，死亡34例，失訪20例；中位存活時間38個月；其中60例接受R-CHOP治療，余不詳；Kaplan-Meier生存分析結果顯示，p65高表達組患者總生存期（overall survival，OS）明顯短于p65低表達組（P=0.038）；PD-1陽性組患者OS明顯短于PD-1陰性組（P=0.015）；PD-L1陽性組患者OS明顯短于PD-L1陰性組（P=0.028）；mPD-L1陽性組患者OS明顯短于mPD-L1陰性組（P=0.010，圖2）。

表5 90例DLBCL患者中腫瘤細胞和微環(huán)境PD-L1表達與臨床病理特征的關系Tab.5 Relationship between expression of PD-L1 or mPD-L1 and clinicopathological characteristics in 90 DLBCL patients

圖2 DLBCL中不同組患者生存曲線比較Fig.2 Comparison of survival curves between different groups of patients in DLBCL

3 討 論

DLBCL具有明顯的侵襲性及異質性，隨著對其不斷的深入研究和了解，針對該疾病的認識不再只是傳統(tǒng)的細胞形態(tài)學及細胞起源，而是更加注重基因改變或信號轉導通路激活對該疾病的影響［14］。

目前研究認為，NF-κB通路在淋巴瘤的發(fā)生和進展以及放化療抵抗中起重要作用，尤其是非生發(fā)中心來源（non-GCB）型DLBCL［2-3，11］。Davis等［15］在活化后細胞來源DLBCL細胞株離體實驗中發(fā)現(xiàn) IKK激酶活性、NF-κB DNA綁定的活性及RAP活性與激活NF-κB通路有關，NF-κB通路激活是患者預后不良的原因之一。PD-1、PD-L1分別為染色體2q37、9p24.2上基因編碼的一對負性共刺激分子，二者共同介導細胞凋亡及腫瘤細胞的免疫逃逸；Kiyasu等［6］、Liu等［12］團隊分別檢測1 253例和92例DLBCL患者發(fā)現(xiàn)，PD-L1蛋白主要表達于non-GCB型DLBCL患者，且均與患者OS顯著相關。目前關于NF-κB通路與PD-1/PD-L1通路是否存在串話（crosstalk）的研究較少，尤其臨床腫瘤研究中尚未見報道。

既往，Li等［7］在胃癌的離體細胞學實驗中使用P65 siRNA對NF-κB/p65基因進行敲出能顯著降低PD-L1的mRNA及蛋白表達，通過構建不同PD-L1基因啟動子，發(fā)現(xiàn)PD-L1啟動子含有一些有效的p65結合元件，提示p65可以作為轉錄因子直接上調PD-L1基因表達；此外，還有體外細胞研究［8-9］在乳腺癌及T細胞淋巴瘤細胞系中證實NF-κB的激活可以促進PD-L1的表達；本次實驗檢測DLBCL蠟塊腫瘤組織NF-κB/P65、PD-L1蛋白發(fā)現(xiàn)：無論腫瘤細胞還是腫瘤微環(huán)境細胞（即TIL）表達PD-L1蛋白均與NF-κB/P65蛋白高表達顯著相關；進一步通過RTFQ-PCR檢測NF-κB/P65蛋白高表達組與低表達組PD-L1的mRNA發(fā)現(xiàn)PD-L1 mRNA在兩組間存在顯著差異，且NFκB/P65蛋白高表達組PD-L1 mRNA相對表達量較高。既往實驗和本研究都提示，DLBCL中PD-L1蛋白及mRNA上調表達與NF-κB/P65蛋白有關。

Yao等［16］在小鼠脊髓損傷后的炎癥反應模型中發(fā)現(xiàn)，PD-1缺乏可以促進NF-κB的激活；但本研究中NF-kB/P65高表達與PD-1蛋白及mRNA均未見相關性。

另外，在本研究中P65、PD-1、PD-L1蛋白表達均與患者OS相關；腫瘤細胞PD-L1陽性患者的IPI評分相對較高且易出現(xiàn)B癥狀；P65主要在non-GCB來源的DLBCL中表達，這些結果都與文獻報道相符合［6，12］。本實驗隨訪數(shù)據(jù)及既往研究結果都提示，P65、PD-1和PD-L1蛋白表達與患者生存預后有關，這些蛋白表達對臨床及生存預后評估都具有潛在價值；但在本次實驗中PD-L1的表達在不同的Hans分型組中差異無統(tǒng)計學意義，這可能是樣本量相對較小或者PD-L1蛋白判讀的cutoff值不同所致。

作為回顧性研究，本實驗樣本量相對較小，結果與大樣本研究相比可能存在偏倚；另外，本實驗RNA的提取，使用的部分組織存儲時間較長，可能會存在部分RNA降解的情況。

綜上所述，DLBCL中PD-1蛋白和mRNA表達與p65蛋白高表達不相關，但PD-L1蛋白及mRNA上調表達均與p65蛋白高表達相關；P65、PD-1和PD-L1蛋白表達與這類淋巴瘤不良預后特別是OS有關，它們在這類淋巴瘤預后評估中的價值有待進一步研究證實。