β-內(nèi)啡肽在RVLM嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的變化

徐凱生，張 麗，張 野

缺血性心臟病是當(dāng)前致死率很高的疾病，如何減輕心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)一直是研究熱點(diǎn)[1-2]。缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning，IPC)可以發(fā)揮較強(qiáng)的內(nèi)源性心肌保護(hù)作用，內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)在其中發(fā)揮重要作用[3]。研究[4]表明中樞嗎啡預(yù)處理(morphine preconditioning，MPC)可以減輕心肌IRI，但其中發(fā)揮作用的具體核團(tuán)與機(jī)制目前研究較少。頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medullar, RVLM)在心臟調(diào)控中扮演了重要的角色，核團(tuán)內(nèi)含有豐富的阿片肽能受體以及多種神經(jīng)遞質(zhì)，其中阿片肽等可通過抑制交感神經(jīng)活動進(jìn)而影響心血管活動[5-6]。現(xiàn)擬通過RVLM核團(tuán)精確給藥來探究該核團(tuán)MPC對于IRI以及外周-β-內(nèi)啡肽(β-endorphin, β-EP)含量的影響，探究外周β-EP在RVLM MPC發(fā)揮心肌保護(hù)作用中的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性成年SD大鼠72只，體質(zhì)量280～320 g。購買并飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2藥物與試劑 鹽酸嗎啡注射液(1 ml ∶10 mg，批號：181101.1)購自沈陽第一制藥廠；氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC，批號129K1867V)購自美國Sigma公司；兔抗c-Fos抗體(anti-c-Fos，批號EPR883.2)、鼠抗β-EP抗體(批號ab54205)購自美國Abcam公司；β-EP ELISA檢測試劑盒(批號CEA806Ra)購自武漢優(yōu)爾生公司；鼠抗β-Actin抗體、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.3儀器 ALC-V9型動物呼吸機(jī)購自上海奧爾科特生物科技有限公司；BL-420s型連接生物機(jī)能系統(tǒng)購自成都泰盟生物科技有限公司；桌面數(shù)顯型腦立體定位儀和微型手持顱骨鉆購自深圳瑞沃德生物科技有限公司；微量輸注泵購自美國KDS公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 核團(tuán)置管與心肌缺血再灌注模型建立苯巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后固定在立體定位儀上，于前后囟之間暴露顱骨，定位RVLM(坐標(biāo)AP 12.2 mm， LR 2.2 mm，H 10 mm)，手持鉆鉆孔突破顱骨后置入導(dǎo)管，用牙科粉固定后縫合皮膚，備用后期給藥。置管后肌注青霉素10萬U，均單籠飼養(yǎng)3 d，有感覺或運(yùn)動障礙等情況的大鼠棄去。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)給藥管用微注射器注射0.25% Evan藍(lán)100 nl，取腦切片，對照大鼠腦圖譜確定注射位點(diǎn)準(zhǔn)確。成功RVLM置管的大鼠，腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，麻醉維持每60～90 min后追加苯巴比妥鈉25 mg/kg 1次。氣管切開、插管后連接動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣, 潮氣量2～4 ml/kg，頻率70～80 次，連接生物系統(tǒng)記錄心電圖(electrocardiogram，ECG)。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm,在左4～5肋間打開胸腔,用撐開器撐開肋骨充分暴露心臟，剪開心包。在肺動脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處以6-0 Prolene線穿過冠狀動脈作一線結(jié)。穩(wěn)定15 min后,扎緊線結(jié)即形成左冠狀動脈閉塞致心肌缺血,表現(xiàn)其支配的局部心肌發(fā)紺、血壓下降, ECG呈心肌梗死改變(ST段抬高或降低等)，松開線結(jié)即可實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3 動物分組RVLM置管模型制備成功的SD大鼠72 只，隨機(jī)均分為4組:假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)、缺血預(yù)處理組(IPC組)和RVLM嗎啡預(yù)處理組 (MPC組)，缺血再灌注模型采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎30 min再灌注120 min，IPC方法為心肌缺血5 min再灌注5 min，重復(fù)處理3 次。Sham組、IR組和IPC組預(yù)先通過導(dǎo)管5 min內(nèi)勻速注射0.9%生理鹽水0.2 μl，間隔5 min后再次輸注，重復(fù)3次，共輸注0.6 μl。之后IR組進(jìn)行缺血再灌注；IPC組在IR前進(jìn)行IPC；MPC組：IR前核團(tuán)注射嗎啡 (5 min內(nèi)勻速注射嗎啡0.2 μl，停5 min，共3次，共輸注0.6 μl，嗎啡按1 μg/kg用生理鹽水配制成0.6 μl)。

1.4 心電圖監(jiān)測監(jiān)測心電圖，于再灌注30 min內(nèi)記錄室性心律失常：室性早搏(premature ventricular contraction，PVCs)及室速/室顫(ventricular tachycardia/ventricular fibrillation，VT/VF)發(fā)生次數(shù)。

1.5 心肌梗死體積的測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠。取出心臟，去除非心臟組織，PBS灌注，沖洗出血液，扎緊左冠狀動脈處的線結(jié)。從主動脈注入0.25% Evan溶液約5 ml。置-80 ℃冰箱速凍2 h。從心尖到結(jié)扎處平切5～6片，厚度2 mm。置1% TTC溶液， 37 ℃(pH 7.4)溫孵10 min染色，用10%福爾馬林固定12 h。Sigma Scan program 4圖像分析軟件計算左心室(left ventricle, LV)、右心室 (right ventricle，RV)、心臟缺血危險區(qū) (area at risk，AAR)和梗死區(qū)(infarct size, IS)面積,×0.2即為各區(qū)體積，計算LV與RV體積之和，IS、AAR體積及IS/ARR比值。

1.6 Western blot檢測c-Fos的相對表達(dá)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即取出大腦，剝離大鼠RVLM核團(tuán)區(qū)域，在預(yù)冷PBS中清洗去除血液，勻漿前稱重。將組織切成均勻小塊，放入冰上裝有RIPA裂解液的勻漿器中勻漿，經(jīng)過超聲裂解至澄清，再將勻漿液3 500 r/min離心5 min，取上清液于-20 ℃下保存。實(shí)驗(yàn)前取上清液進(jìn)行Western blot檢測，在收集的蛋白樣品中按1 ∶4加入上樣緩存液，沸水浴加熱10 min。樣品冷卻后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗滌后，分別加入actin一抗(稀釋度1 ∶1 000)、c-Fos一抗(稀釋度1 ∶1 000)，4 ℃緩慢搖動孵育過夜。次日PBST洗滌3次每次10 min，二抗用山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)或山羊抗兔IgG(1 ∶20 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次4 min，暗室進(jìn)行ECL顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 脊髓、心肌免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry, IHC)大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫頸處死，灌流后立即取出心臟和T2-5段脊髓，用4%多聚甲醛浸泡12 h以上，脫水、常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，厚度5 μm，脫臘后抗原高壓修復(fù)，3% H2O2室溫孵育20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS沖3次甩干加二抗37 ℃孵育20 min，PBS沖3遍甩干加DAB顯色劑3 min，蘇木精襯染后封片觀察。鏡下觀察β-EP的陽性反應(yīng)(細(xì)胞質(zhì)染成棕色或褐色)并拍照。

1.8 ELISA試劑盒檢測β-EP水平實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取LV心肌、T2-5脊髓，放入-80 ℃保存。檢測前提取組織蛋白嚴(yán)格按照β-EP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀分別測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和各組脊髓、心肌樣品在450 nm波長下的吸光度，計算各樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死體積各組LV+RV體積及AAR體積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組比較，IR組的IS體積和IS/AAR比值升高(P<0.01)；與IR組比較，IPC組和MPC組的IS體積、IS/AAR降低(F=47.08，P<0.05)。見圖1。

圖1 TTC染色法檢測各組大鼠心肌梗死體積(n=6)

A：TTC染色; B:IS/AAR統(tǒng)計分析; C:AAR/(LV+RV)統(tǒng)計分析; 與Sham組比較:**P<0.01; 與IR組比較:#P<0.05

2.2 心律失常發(fā)生次數(shù)與Sham組比較，IR組的PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)升高(P<0.01)；與IR組比較，IPC組和MPC組的PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)減少(F1=73.0，F(xiàn)2=46.03，P<0.01)。見表1。

2.3 c-Fos蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果Western blot結(jié)果顯示IR組RVLM中c-Fos蛋白表達(dá)量較Sham組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IR組比較，IPC組和MPC組的c-Fos表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.15，P<0.01)。見圖2。

表1 各組大鼠PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)的比較(次，n=6)

與Sham組比較：aP<0.01；與IR組比較：bP<0.01

圖2 Western blot檢測c-Fos蛋白表達(dá)水平(n=6)

與Sham組比較：**P<0.01；與IR組比較：##P<0.01

2.4 左心室肌和脊髓中β-EP表達(dá)的ELISA檢測和IHC結(jié)果ELISA結(jié)果顯示IR組T2-5脊髓和左心室肌中β-EP表達(dá)量較Sham組增高(P<0.01)；與IR組比較，IPC組和MPC組脊髓和左心室肌中的β-EP表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F1=30.94，F(xiàn)2=11.49，P<0.01)。見圖3。IHC的結(jié)果顯示各組脊髓與左心室肌樣本中內(nèi)啡肽陽性反應(yīng)大小差異與ELISA結(jié)果相同。見圖4。

3 討論

本研究參照大鼠腦圖譜定位RVLM核團(tuán)，參考文獻(xiàn)[7-8]建立核團(tuán)給藥模型和大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，并設(shè)置缺血預(yù)處理組作為對照。結(jié)果表明，大鼠缺血時結(jié)扎范圍心肌發(fā)紺，心電圖提示心肌缺血，TTC染色結(jié)果梗死明顯，且IPC組較IR組梗死體積減少，證實(shí)缺血預(yù)處理和大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備是成功且穩(wěn)定的，此模型可用于探究RVLM MPC對IRI的影響。研究結(jié)果表明RVLMMPC后減少了IR后惡性心律失常的發(fā)生次數(shù)，有助于改善心臟功能，并在一定程度上減輕了心肌IRI。

圖3 ELISA法檢測各組大鼠T2-5脊髓和左心室

A：T2-5脊髓；B：左心室心?。慌cSham組比較：**P<0.01；與IR組比較：##P<0.01

研究[9]發(fā)現(xiàn)心肌IR后可以引起大腦多個核團(tuán)內(nèi)c-Fos表達(dá)上調(diào)，側(cè)腦室MPC可以降低心肌IR引起的孤束核內(nèi)c-Fos高表達(dá)。有研究[10]發(fā)現(xiàn)抑制大鼠腦內(nèi)c-Fos表達(dá)可降低有害性刺激引起的大鼠心血管反應(yīng)。有報道[11-12]顯示心肌缺血后T2-6脊髓背角SG區(qū)神經(jīng)元興奮性增高，鞘內(nèi)MPC能降低心肌缺血引起的T2-6脊髓背角中c-Fos蛋白的高表達(dá)。c-Fos表達(dá)水平在一定程度上可以反映中樞傷害性神經(jīng)元的興奮性程度。本研究結(jié)果顯示心肌IR后RVLM內(nèi)c-Fos表達(dá)明顯增高，而IPC和MPC可以減少c-Fos表達(dá)，提示RVLM MPC可能通過抑制心肌缺血后RVLM核團(tuán)內(nèi)傷害性神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而產(chǎn)生對心肌缺血傷害性刺激的中樞調(diào)控作用。

有研究[13-14]證實(shí)EP在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中有一定的心肌保護(hù)作用，另外內(nèi)源性阿片肽參與介導(dǎo)了IPC誘導(dǎo)的心臟保護(hù)作用。本研究結(jié)果也表明心肌IR會引起T2-5脊髓和左心室肌中β-EP含量增加，缺血預(yù)處理后β-EP含量更高。大量研究表明起源于心臟的內(nèi)臟傳入纖維的胞體位于T2-6節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)，心臟的傷害性傳入信息主要通過DRG進(jìn)行第一級傳導(dǎo)，之后通過迷走傳入并終止與孤束核。而RVLM可以接受多個核團(tuán)傳入的興奮性信號，其中就包括下丘腦室旁核、孤束核和延髓尾端加壓區(qū)等核團(tuán)，這些區(qū)域的變化將直接影響RVLM對交感輸出和心血管功能的控制，可見RVLM、胸段脊髓與心臟之間有著密切的聯(lián)系[15]。本研究結(jié)果表明RVLM MPC后，T2-5脊髓和左心室肌中EP含量明顯增高，提示RVLM核團(tuán)內(nèi)阿片受體激活后通過激活中樞EP系統(tǒng)調(diào)節(jié)外周EP釋放發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

圖4 IHC檢測各組T2-5脊髓和左心室肌中β-EP的表達(dá) ×20

綜上所述，RVLM MPC降低了心肌IR后核團(tuán)內(nèi)c-Fos蛋白的表達(dá)水平，增加了脊髓和左心室肌組織內(nèi)β-EP含量，β-EP可能介導(dǎo)了RVLM MPC所發(fā)揮的心肌保護(hù)作用，為研究心肌IRI的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新靶點(diǎn)和方向。