六種國產(chǎn)乙型肝炎表面抗體ELISA試劑盒符合率及cut-off值探討

韓瑋瑋，金齊力，劉嘉清，王蓮子，郝 麗，閆 川，沈 翔，肖春紅，李 濤，周 敏，徐勝前

乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B virus surface antibody, HBsAb)是一種保護性乙型肝炎病毒抗體，是判斷機體對乙型肝炎病毒是否有免疫力的主要指標(biāo)，也是判斷乙型肝炎病毒疫苗是否需要加強接種的指標(biāo)。HBsAb有多種檢測方法，應(yīng)用最廣泛、性價比最高的仍然是酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。HBsAb ELISA試劑盒生產(chǎn)廠家很多，不同廠家試劑盒檢測性能指標(biāo)存在一定差異，給臨床應(yīng)用帶來了一定的困惑。該研究探討了六種國產(chǎn)HBsAb ELISA試劑盒的精密度、符合率、試劑盒cut-off值的合適性以及采用cut-off血清的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 北京康徹思坦公司生物技術(shù)有限公司的HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度水平10 mIU/ml，批號201801001。

1.1.2臨床標(biāo)本 來源于蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2016年10～11月經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法(electro chemiluminescence immunoassay, ECLIA)檢測為陰性的標(biāo)本24份(濃度值<10 mIU/ml)，陽性標(biāo)本91份(其中濃度值10～<50 mIU/ml標(biāo)本30份，50～<100 mIU/ml標(biāo)本19份，100～1 000 mIU/ml標(biāo)本42份)。

1.2 樣品處理2個濃度水平的HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以L1、L2表示，L1為10 mIU/ml，使用生理鹽水對10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行1 ∶1稀釋獲得的L2為5 mIU/ml。臨床標(biāo)本為清晨空腹抽取患者全血2 ml，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心5 min分離血清。所有臨床標(biāo)本均為已經(jīng)完成臨床檢測后的患者待廢棄標(biāo)本。

1.3 儀器與試劑Addcare ELISA 1800全自動酶免工作站購自煙臺艾德康生物科技有限公司；Roche cobas 4000 e411電化學(xué)發(fā)光儀購自德國羅氏診斷有限公司。HBsAbE ELISA試劑盒分別購自國內(nèi)的六個廠家，用試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E、試劑F表示，批號為2018076216(A)、201805091(B)、20180606205(C)、20180712(D)、R20180805A(E)、201806019-2(F)。HBsAb ECLIA試劑盒購自意大利索林診斷有限公司，批號：38849301。所有試劑均有醫(yī)療器械注冊證并且在有效期內(nèi)。

1.4 檢測原理所有試劑均采用雙抗原夾心法檢測HBsAb。

1.5 檢出限及cut-off值驗證一般認為HBsAb>10 mIU/ml對機體產(chǎn)生有效的保護作用，因此本試驗采用10 mIU/ml作為檢出限及cut-off值合適性的判斷依據(jù)。將10 mIU/ml和5 mIU/ml兩個濃度的標(biāo)本重復(fù)檢測24次，根據(jù)試劑盒說明書計算cut-off值，根據(jù)cut-off值判斷陰性或陽性，計算陽性率。

1.6 C5、C50和C95的定義C5表示有5%的檢測孔陽性，C50表示有50%的檢測孔陽性，C95表示有95%的檢測孔陽性。

1.7 以cut-off血清確定ELISA試劑盒cut-off值及灰區(qū)以10 mIU/ml的HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為cut-off血清，C50作為cut-off值，C5～C95作為灰區(qū)。利用確定的cut-off值和灰區(qū)分析5 mIU/ml的HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和臨床陰性、陽性標(biāo)本的檢測結(jié)果。

1.8 臨床標(biāo)本ECLIA定量結(jié)果的定性判斷用ECLIA檢測10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，連續(xù)檢測20個工作日，每個工作日檢測1次，獲得的為(9.87±0.37)mIU/ml，變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)為3.75%。根據(jù)10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的作為灰區(qū)，則灰區(qū)范圍為(9.13～10.61)mIU/ml，濃度值低于9.13 mIU/ml判定為陰性，高于10.61 mIU/ml判定為陽性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較選用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 計算cut-off值六家HBsAb ELISA試劑盒說明書中cut-off值計算方式均為2.1倍的陰性對照OD值的均值，根據(jù)試驗結(jié)果，六家試劑盒cut-off值均為0.105。

2.2 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的陽性率六家HBsAb ELISA試劑盒檢測10 mIU/ml標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，A試劑L1水平結(jié)果有3個孔屬于無效結(jié)果，予以剔除。E、F兩家試劑陽性率為100%，其他四家試劑陽性率均低于20%。檢測5 mIU/ml標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，結(jié)果全部陰性。具體結(jié)果見表1。

表1 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的陽性率

2.3 六家HBsAb ELISA試劑盒精密度分析六家HBsAb ELISA試劑盒在HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度10 mIU/ml和5 mIU/ml時的OD值分布及變異系數(shù)見表2、圖1。試劑C、E的精密度最高，試劑A、F次之，試劑B、D精密度最差。

圖1 六家HBsAb ELISA試劑盒精密度分析

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：10 mIU/ml；2：5 mIU/ml

表2 六家HBsAb ELISA試劑在HBsAb濃度10 mIU/ml和5 mIU/ml時的OD值分析

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：10 mIU/ml；2：5 mIU/ml

圖2 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的C5、C50和C95

2.4 10 mIU/ml濃度HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為cut-off血清的cut-off值和灰區(qū)分析分析得出六種試劑的C5、C50、C95分別為：試劑A(0.113、0.089、0.072)，試劑B(0.095、0.051、0.039)，試劑C(0.109、0.085、0.075)，試劑D(0.052、0.039、0.003)，試劑E(0.167、0.135、0.12)，試劑F(0.232、0.156、0.117)，見圖2。10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的C50作為cut-off值，C5～C95作為灰區(qū)，六家試劑的cut-off值和灰區(qū)范圍差別較大，試劑D的cut-off值最低，灰區(qū)范圍最小，試劑F的cut-off值最高，灰區(qū)范圍最大。見圖2～4。

2.5 5 mIU/ml濃度HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測結(jié)果分析以10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確定的cut-off值和灰區(qū)范圍，分析5 mIU/ml濃度HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果，試劑B有8.33%的數(shù)據(jù)落在灰區(qū)范圍，試劑D有18.18%的數(shù)據(jù)落在灰區(qū)范圍，所有試劑的結(jié)果均沒有超過灰區(qū)范圍上限。見圖5。

2.6 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果分析以10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確定的cut-off值和灰區(qū)范圍，用ECLIA檢測結(jié)果判定的陰性或陽性為標(biāo)準(zhǔn)，分析六種ELISA試劑盒臨床標(biāo)本結(jié)果符合率，并與試劑盒cut-off值判定結(jié)果符合率比較。

圖3 六家試劑盒以10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)C50作為cut-off值的分析

圖4 六家HBsAb ELISA試劑盒以10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)C5～C95作為灰區(qū)的分析

2.6.1臨床陰性標(biāo)本檢測結(jié)果分析 試劑A用兩種cut-off值判定結(jié)果陰性符合率均為100%，試劑B、C、D試劑盒cut-off值判定結(jié)果的陰性符合率高于cut-off血清，試劑E、F cut-off血清判定結(jié)果的陰性符合率高于試劑盒cut-off值。但是cut-off血清判定結(jié)果的陰性符合率與試劑盒cut-off值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體結(jié)果見圖6、7。

2.6.210～<50 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本檢測結(jié)果分析 試劑E用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率均為100%，試劑A用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率均為70%，試劑B、C、D cut-off血清判定結(jié)果的陽性符合率高于試劑盒cut-off值，試劑F試劑盒cut-off值判定結(jié)果的陽性符合率高于cut-off血清。F試劑cut-off血清判定結(jié)果的陽性符合率小于試劑盒cut-off值(P<0.05)其余試劑二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8、9。

2.6.350～<100 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本檢測結(jié)果分析 試劑A、E用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率均為100%，試劑B、C、D cut-off血清判定結(jié)果的陽性符合率高于試劑盒cut-off值，試劑F試劑盒cut-off值判定結(jié)果的陽性符合率高于cut-off血清。但是cut-off血清判定結(jié)果的陰性符合率與試劑盒cut-off值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖10、11。

圖5 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測5 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果分析

圖6 六家HBsAb ECLIA及ELISA試劑盒檢測臨床陰性標(biāo)本的OD值分布

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；a：ECLIA；b：ELISA

圖7 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測臨床陰性標(biāo)本的符合率

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：使用cut-off血清判定結(jié)果；2：使用試劑盒cut-off值判定結(jié)果

2.6.4100～1 000 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本檢測結(jié)果分析 六種試劑用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率均為100%。見圖12、13。

圖8 六家HBsAb ECLIA及ELISA試劑盒檢測10～<50 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本的OD值分布

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；a：ECLIA；b：ELISA

圖9 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測10～<50 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本的符合率

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：使用cut-off血清判定結(jié)果；2：使用試劑盒cut-off值判定結(jié)果

3 討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球最大的公共衛(wèi)生問題之一，世界衛(wèi)生組織(world health organization ,WHO)建議在新生兒出生后24 h內(nèi)接種第一針乙型肝炎疫苗，但是在完成3～4次疫苗注射后仍有2%的嬰兒發(fā)生無反應(yīng)或反應(yīng)不良[1]。并且新生兒免疫后隨著接種年限的增長，HBsAb陽性率下降，平均滴度水平下降。目前普遍認為，普通人群HBsAb濃度≥10 mIU/ml有保護作用，但機體對HBV的免疫力較弱，荷蘭、比利時和瑞士等國家建議HBsAb濃度在10～100 mIU/ml時需加強免疫[2]。因此，需要定期檢測HBsAb濃度水平，及時做好免疫強化[3]。

圖10 六家HBsAb ECLIA及ELISA試劑盒檢測50～<100 mIU/ml濃度標(biāo)本的OD值分布

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；a：ECLIA；b：ELISA

圖11 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測50～<100 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本的符合率

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：使用cut-off血清判定結(jié)果；2：使用試劑盒cut-off值判定結(jié)果

圖12 六家HBsAb ECLIA及ELISA試劑盒檢測100～1 000 mIU/ml濃度標(biāo)本的OD值分布

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；a：ECLIA；b：ELISA

圖13 六家HBsAb ELISA試劑盒檢測100～1 000 mIU/ml濃度臨床標(biāo)本的符合率

A：試劑A；B：試劑B；C：試劑C；D：試劑D；E：試劑E；F：試劑F；1：使用cut-off血清判定結(jié)果；2：使用試劑盒cut-off值判定結(jié)果

近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平的不斷發(fā)展對醫(yī)學(xué)檢驗提出了許多新要求，當(dāng)前的實驗室管理越來越規(guī)范化、系統(tǒng)化，不同的實驗室都制定了相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，在質(zhì)量管理體系的建立和運行中方法學(xué)的性能驗證是一項重要環(huán)節(jié)。目前HBsAb濃度有多種檢測方法，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)、化學(xué)發(fā)光法(CLIA)等， ELISA法雖為定性試驗，但其操作簡便、試劑價格便宜而且靈敏度相對較高, 臨床應(yīng)用最廣泛，為當(dāng)前絕大部分臨床實驗室HBsAb篩查的主要檢測方法。臨床定性免疫檢驗重要常規(guī)檢驗項目的分析質(zhì)量控制指標(biāo)主要包括：精密度、符合率、最低檢出限等[4]。對HBsAg檢測方法的精密度、準(zhǔn)確度的評價可以反映出實驗室選用檢測試劑方法的正確性和臨床應(yīng)用價值[5]。在進行HBsAb水平檢測時，其低濃度水平有一定臨床意義，因此檢測方法的下限性能也很關(guān)鍵[6]。表1顯示，只有E、F兩家試劑符合其試劑說明書上標(biāo)示國家要求的最低檢出限標(biāo)準(zhǔn)(≤10 mIU/ml)[4]，其余四家均不能達到國家標(biāo)準(zhǔn)。這與試劑盒的分析特異性以及內(nèi)源性或外源性干擾因素有關(guān)。

精密度是n次重復(fù)測定結(jié)果彼此相符合程度。表2和圖1可以看出只有試劑C、E的兩個濃度水平CV值均≤15%，因此這兩種試劑精密度高。試劑B、D兩種濃度水平的精密度差異顯著。

cut-off值改變會影響檢測結(jié)果的假陽性率和假陰性率，對于定性實驗而言， C50是常用的cut-off值確定方式，每個實驗室應(yīng)評估試劑盒說明書提供的cut-off值合適性。當(dāng)標(biāo)本內(nèi)分析物濃度水平在臨界值C50時對其進行重復(fù)性檢測能夠獲得50%陽性結(jié)果和50%陰性結(jié)果。C5表示當(dāng)標(biāo)本中分析物在這一濃度水平時能獲得5%陽性結(jié)果和95%陰性結(jié)果，C95表示當(dāng)標(biāo)本中分析物在這一濃度水平時能獲得95%陽性結(jié)果和5%陰性結(jié)果，當(dāng)分析物濃度位于C5～C95之外，候選方法對同一樣本的重復(fù)性檢測將得到相同結(jié)果[4]。國內(nèi)絕大部分試劑盒都是以2.1倍陰性對照均值為cut-off值(陰性對照OD<0.05時以0.05計算)，這種計算方法過于粗糙。該文采用EP12-A2《定性試驗評價方法用戶協(xié)議》[7]，以HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為cut-off血清，C50作為cut-off值，C5～C95作為灰區(qū)，探討其可行性。C5～C95區(qū)間越窄,代表該試劑的精密度越大。圖5以10 mIU/ml HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確定的cut-off值和灰區(qū)范圍，分析5 mIU/ml濃度HBsAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果，所有試劑的結(jié)果均沒有超過灰區(qū)范圍上限，說明此cut-off值是可行的。但是根據(jù)圖2～4，E、F試劑的cut-off值超過試劑盒規(guī)定值，而且所有試劑C95均超過C50+20%，存在灰區(qū)范圍過大的嫌疑，這樣務(wù)必給臨床工作帶來增加重檢率的負擔(dān)。

經(jīng)過使用國家標(biāo)準(zhǔn)品的驗證，該試驗使用的ECLIA試劑精密度和準(zhǔn)確性均較高[8]，在臨床標(biāo)本的符合率分析中，以ECLIA結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)驗證六種國產(chǎn)試劑盒的符合率。圖6～13顯示，當(dāng)HBsAb濃度≥100 mIU/ml或<10 mIU/ml時，大部分試劑用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率較高；當(dāng)10 mIU/ml≤HBsAb濃度<100 mIU/ml時，大部分試劑用兩種cut-off值判定結(jié)果陽性符合率差異明顯。由此可見，當(dāng)標(biāo)本的OD值離cut-off值較遠時對陰陽性結(jié)果判定影響不大，當(dāng)標(biāo)本OD值在cut-off 值附近時對陰陽性結(jié)果判定影響較大。

目前我國有專門的檢驗校準(zhǔn)機構(gòu)對臨床實驗室使用的試劑進行定期定批質(zhì)量檢定[9]。HBsAb各生產(chǎn)廠家的試劑說明書也明確標(biāo)示其各項性能指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，但是在臨床使用中因?qū)嶒炇噎h(huán)境、人員因素、設(shè)備因素各異，或許不能達到理想水平，從而引起一定程度的誤檢、漏檢，因此實驗室在選取試劑盒時一定要做性能驗證，避免過多的假陰性或假陽性結(jié)果，規(guī)避偶然誤差對檢測結(jié)果的影響，這樣才能最大地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值。