P188抑制大鼠自體脂肪移植炎癥浸潤(rùn)的實(shí)驗(yàn)研究

李吟秋,倪子樵,王 鑫,宋家騫,朱 飛

近年，自體脂肪移植已成為修復(fù)軟組織缺損的有效方法。移植過(guò)程中脂肪組織因遭受破壞而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是存活率低的原因之一[1]。由于創(chuàng)傷，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子釋放引起炎癥反應(yīng)。創(chuàng)傷愈合過(guò)程中多種炎癥細(xì)胞在創(chuàng)傷局部浸潤(rùn)并引起促纖維化因子的分泌，以致成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷發(fā)生后機(jī)體愈合過(guò)程中增殖導(dǎo)致瘢痕[2]。當(dāng)感受到炎癥刺激和危險(xiǎn)信號(hào)的存在，巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生相關(guān)變化并且釋放活性物質(zhì)以及炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、IL-1、IL-6，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等[3-4]。

Poloxamer 188(P188)是一種三嵌段聚合物，可以在細(xì)胞膜破損時(shí)有效恢復(fù)受損細(xì)胞膜的完整性[5]。已有文獻(xiàn)證明[6]，P188可以減輕興奮性腦損傷后的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以減輕炎癥反應(yīng)，但尚無(wú)文獻(xiàn)針對(duì)P188對(duì)自體脂肪移植的炎癥浸潤(rùn)情況進(jìn)行報(bào)道。該研究將在大鼠自體游離脂肪移植模型中，觀察P188對(duì)大鼠自體脂肪移植炎癥浸潤(rùn)的影響以及對(duì)移植術(shù)后存活率的影響作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料表面活性劑Kolliphor?P188(美國(guó)Sigma公司)；ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；TRIzol (美國(guó)lnvitrogen公司)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 隨機(jī)選取36只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，均購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)室條件下，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持飼養(yǎng)環(huán)境的晝夜節(jié)律。造模前，36只大鼠常規(guī)進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠6只，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料，采取自由飲水，維持室溫在21～26 ℃，室內(nèi)濕度控制在(50±5)%。將36只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組18只，分為對(duì)照組(生理鹽水組)和實(shí)驗(yàn)組(P188組)。兩組大鼠于同一時(shí)間采取自體脂肪移植，于術(shù)后1、2、4周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出標(biāo)本。

1.2.2動(dòng)物脂肪移植 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用10%水合氯醛腹腔麻醉，固定，脫毛，消毒，鋪巾，于恥骨聯(lián)合上方1 cm作切口夾取皮下脂肪組織，切取脂肪組織約0.4 ml后，結(jié)扎血管，縫合傷口。將取出的脂肪組織用組織剪除去包膜與血管后，剪碎，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組需要，分別用生理鹽水與一定濃度的藥物浸潤(rùn)處理30 min，留置待用。背部脫毛消毒鋪巾，在脊柱兩側(cè)分別作約1.5 cm圓形標(biāo)記區(qū)域，分別作一小切口，止血鉗皮下鈍性分離，將剪碎的脂肪組織分別用生理鹽水和相應(yīng)濃度的藥物處理后，用1 ml注射器分別將處理好的脂肪組織對(duì)應(yīng)注射進(jìn)分離好的間隙，每只大鼠背部?jī)蓚?cè)各注入脂肪組織(0.2±0.02)ml，體質(zhì)量約為(0.25±0.05)g，最后縫合傷口。分別在術(shù)后1、2、4周取出移植脂肪組織。同時(shí)腹主動(dòng)脈取血，置于離心機(jī)以6 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃凍存,用于ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.3脂肪組織稱重及體積測(cè)量 將取出組織置于無(wú)菌操作臺(tái)上，去除其表面覆蓋的筋膜。用超精密電子秤稱重。取1 ml醫(yī)用注射器，用蠟塊封死注射器的針尖端，在自制注射器中加入0.4 ml蒸餾水，依次將取出的脂肪組織放置入內(nèi)，記錄量筒內(nèi)液面上升的高度，高度差即是取出的脂肪組織體積。

1.2.4組織學(xué)觀察 將取出的脂肪組織用10%福爾馬林固定24 h，經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定，津蠟，包埋，2 μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察脂肪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.5實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)炎癥因子的mRNA表達(dá) 將各組脂肪組織用Trizol裂解后，勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書，抽提總RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)引物，然后使用SYBR Green PCR mix 試劑盒分別檢測(cè)IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平，后用Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子的mRNA表達(dá)。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子的蛋白表達(dá) 檢測(cè)IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)情況。將血清樣品從冰箱取出，用恒溫水浴箱解凍，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書，經(jīng)過(guò)包被抗體洗滌，加入血清樣品孵育洗滌，加入酶標(biāo)再孵育洗滌和加底物顯色等步驟，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取OD值。

2 結(jié)果

2.1 脂肪組織稱重及體積測(cè)量結(jié)果顯示，脂肪移植1、2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間體質(zhì)量和體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4周時(shí)對(duì)照組體質(zhì)量為(0.13±0.02)g，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量為(0.19±0.02)g，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.781,P<0.01)；4周時(shí)對(duì)照組體積(0.15±0.03)ml，實(shí)驗(yàn)組體積為(0.19±0.01)ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.347,P<0.05)。見圖1。

圖1 P188對(duì)移植后脂肪組織的體積和體質(zhì)量的影響

A：體積；B：體質(zhì)量；與生理鹽水組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.2 組織學(xué)觀察HE染色顯示，對(duì)照組炎癥反應(yīng)較強(qiáng)，炎性細(xì)胞占據(jù)大部分視野，結(jié)構(gòu)紊亂，脂肪細(xì)胞松散無(wú)規(guī)律，可見脂肪液化以及壞死。至4周時(shí)可見纖維結(jié)締組織較多。而添加了P188的實(shí)驗(yàn)組在2周時(shí)可見到較多脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，至4周時(shí)可見組織間隔不多，新生脂肪細(xì)胞排列相對(duì)整齊，形態(tài)規(guī)則。見圖2。

2.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)炎癥因子的mRNA表達(dá)4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組移植脂肪組織中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中IL-1α、IL-1β、IL-6(FIL-1α=45.158， FIL-1β=137.533，F(xiàn)IL-6=65.187，P<0.05)，TNF-α(FTNF-α=365.781，P<0.01)。見圖3。

2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子的蛋白表達(dá)圖4結(jié)果顯示在自體脂肪移植4周時(shí)，P188作用實(shí)驗(yàn)組可以降低炎癥因子1L-1β、IL-6、以及TNF-α的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中IL-1β、IL-6(FIL-1β=34.607，F(xiàn)IL-6=16.224，P<0.05)，TNF-α(FTNF-α=198.633，P<0.01)。而IL-1α的蛋白表達(dá)水平雖然有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FIL-1α=54.657，P>0.05)。

圖2 HE染色觀察移植后脂肪組織炎癥浸潤(rùn) ×200

圖3 兩組炎癥因子mRNA的表達(dá)情況

圖4 兩組炎癥因子蛋白表達(dá)情況

3 討論

自Neuber于1893年完成第一例脂肪移植術(shù)至今，自體脂肪移植已經(jīng)成為當(dāng)下整形手術(shù)以及組織修復(fù)重建手術(shù)的熱點(diǎn)。由于脂肪移植存在多個(gè)步驟，且會(huì)對(duì)局部組織造成一定程度的損傷，伴隨的炎癥反應(yīng)不可避免的會(huì)對(duì)移植存活率造成影響。炎癥反應(yīng)存在于多種病理過(guò)程中，炎癥反應(yīng)的激活、炎癥細(xì)胞因子的分泌對(duì)創(chuàng)傷發(fā)生后機(jī)體愈合過(guò)程中局部組織的修復(fù)和功能的重建有著重要影響作用。除巨噬細(xì)胞之外，局部炎癥反應(yīng)對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖也有促進(jìn)作用[7]，在局部創(chuàng)面愈合過(guò)程中，促炎性因子的分泌，炎性細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活，從而引起成纖維細(xì)胞的增殖。研究表明[8]，促炎因子的高表達(dá)，抑炎因子的低表達(dá)，促進(jìn)形成瘢痕組織及瘢痕疙瘩。

脂肪組織中除脂肪細(xì)胞外，還有成纖維細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞是與炎癥相關(guān)的至關(guān)重要的細(xì)胞之一。由于炎癥反應(yīng)集中在脂肪移植術(shù)后早期階段，故為驗(yàn)證P188對(duì)脂肪移植的影響作用，取出脂肪組織的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置在移植后早期，通過(guò)評(píng)估P188對(duì)脂肪移植的早期影響作用，可以有效評(píng)估其遠(yuǎn)期效果[9]。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，在脂肪移植過(guò)程中，移植的成熟脂肪細(xì)胞會(huì)因缺氧缺血而凋亡，而前體脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞來(lái)替代壞死細(xì)胞，從而重新構(gòu)建移植脂肪的結(jié)構(gòu)。高水平的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)抑制前體脂肪細(xì)胞的成脂傾向，因此可以推斷，抑制脂肪移植炎癥反應(yīng)，會(huì)對(duì)脂肪移植存活率產(chǎn)生影響。正常生理環(huán)境下，脂肪細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)受到環(huán)境威脅時(shí)，穩(wěn)定狀態(tài)失衡，促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增加從而使巨噬細(xì)胞活化。與巨噬細(xì)胞一樣，脂肪細(xì)胞表達(dá)了大量受體，對(duì)炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)非常敏感，多個(gè)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，分泌相關(guān)炎癥因子[11]。脂肪細(xì)胞對(duì)TNF-α十分敏感，TNF-α對(duì)脂肪細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生多種影響, 包括活化細(xì)胞因子的基因表達(dá)[12]。

Poloxamer188是一種合成表面活性劑，是一種非離子三嵌段共聚物，可插入人工脂質(zhì)單層膜中，修復(fù)受損的生物膜。已有文獻(xiàn)[13]研究證明，P188可以減輕興奮性腦損傷后的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，以減輕炎癥反應(yīng)。Ruhl et al[14]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)P188對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖及分化有促進(jìn)作用，對(duì)相關(guān)因子的釋放如IGF-1 ，VEGF等雖有影響，但作用甚微，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)移植后1、2、4周的脂肪炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表面活性劑P188對(duì)移植前兩周的脂肪細(xì)胞保護(hù)和抑制炎癥浸潤(rùn)的作用并不明顯，與生理鹽水組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而4周組的結(jié)果表明，P188組不僅能抑制炎癥的浸潤(rùn)并且可以抑制炎癥因子1L-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA和蛋白水平的表達(dá)(與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1L-1β、IL-6,P<0.05; TNF-α,P<0.01)。

綜上所述， 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察和數(shù)據(jù)的比較，P188可以減輕自體脂肪移植術(shù)過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。因此也可以推斷，在創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域，因P188對(duì)炎癥反應(yīng)具有抑制效應(yīng)，而對(duì)瘢痕以及瘢痕疙瘩的形成具有抑制作用，在整形外科修復(fù)創(chuàng)面方面的應(yīng)用有待發(fā)掘。