大籽蒿花粉新致敏蛋白組分肌動蛋白(組裝)抑制蛋白的鑒定、致敏性及表位

胡巧麗，許志強，潘晨，朱理想，魏繼福

蒿屬類花粉是一種重要的過敏原，廣泛分布于世界各國[1]。中國有187種蒿屬植物，分布遍及全國[1]，與夏秋季花粉癥密切相關(guān)[2]。大籽蒿花粉是我國常見的致敏花粉之一，其點刺液廣泛用于臨床蒿屬過敏診斷[3]。然而，大籽蒿花粉致敏組分的蛋白類別、序列信息及致敏情況尚無深入研究。

肌動蛋白(組裝)抑制蛋白(profilin)致敏性在多個物種中均有報道，如花粉、食物、膠乳等，并且存在廣泛的交叉致敏性[4-6]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)法對大籽蒿花粉中的profilin進(jìn)行鑒定和表征，并綜合分析大籽蒿profilin的潛在IgE結(jié)合表位和三維結(jié)構(gòu)特征，以完善大籽蒿花粉的過敏原信息。

1 材料與方法

1.1 材料

大籽蒿花粉轉(zhuǎn)錄組測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，DNA引物序列合成及克隆菌基因測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR試劑盒、T/A克隆試劑盒(pMD19-T載體)、DNA膠純化試劑盒、NcoⅠ和XhoⅠ酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等均購于寶生物工程(大連)有限公司。重組克隆試劑盒購于諾維贊公司。TMB顯色液、ELISA終止液購于碧云天生物技術(shù)公司，ECL顯影液和PVDF膜購于Merck集團(tuán)。Anti-IgE購于美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 大籽蒿花粉profilin基因擴(kuò)增和克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，使用局部序列比對工具(BLAST)，將測序得到的剪接序列與IUIS數(shù)據(jù)庫中收集的已知profilin序列進(jìn)行比較，找到一個潛在的profilin序列并設(shè)計全長引物(圖1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、TA克隆和重組克隆。

1.2.2 大籽蒿花粉profilin表達(dá)純化

提取重組菌的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL-21感受態(tài)細(xì)胞中，用終濃度1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，并通過SDS-PAGE篩選成功表達(dá)的菌落進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)。隨后超聲裂解菌體，利用SDS-PAGE凝膠電泳確定蛋白表達(dá)形式，并通過Ni-NTA凝膠對目的蛋白進(jìn)行純化。若以包涵體表達(dá)，則在含8 mol/L尿素的變性條件下進(jìn)行純化并梯度透析除去尿素。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

將10 μg/mL純化的大籽蒿profilin，4 ℃包被過夜。將蒿屬過敏患者血清1∶10稀釋作為一抗，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法與Lin[7]描述相同。

1.2.4 免疫印跡試驗

10 μg純化的大籽蒿profilin上樣跑電泳，以ELISA陽性血清1∶10稀釋作為一抗，免疫印跡試驗(Western blot)方法與Kim[8]描述一致。

1.2.5 大籽蒿花粉profilin保守性分析

根據(jù)所鑒定大籽蒿花粉中profilin的氨基酸序列，利用clustalX2與其他物種中的profilin進(jìn)行多重序列比對，包含花粉類過敏原艾蒿Art v 4、豚草Amb a 8、樺樹Bet v 2、橄欖樹Ole e 2和向日葵Hel a 2，食物類過敏原花生Ara h 5和榛子Cor a 2及接觸類過敏原膠乳Hev b 8(http://www.aller-gen.org/)。明確大籽蒿花粉profilin中高度保守的氨基酸序列。

1.2.6 大籽蒿花粉profilin結(jié)構(gòu)模擬

利用同源模擬法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。首先在SIWSS-MODEL服務(wù)器(https://swissmodel.expasy. org/)中導(dǎo)入profilin的氨基酸序列，選取與其序列一致性最高的模板進(jìn)行模型構(gòu)造，并利用procheck、ERRAT、Verify 3D、ProSA和QMEAN法對所得結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量進(jìn)行評價。

圖 1大籽蒿花粉profilin核苷酸序列和氨基酸序列

Fig1Nucleotide and amino acid sequence ofArtemisiasieversianapollen profilin

1.2.7 大籽蒿花粉profilin IgE表位分析

結(jié)合大籽蒿花粉profilin氨基酸殘基的物理化學(xué)性質(zhì)和所獲得的三維結(jié)構(gòu)模型，對其B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合分析。首先，在DNASTAR中通過親水性、柔性、表面可及性和抗原性參數(shù)篩選符合條件的線性表位；隨后使用結(jié)合hidden Markov模型和傾向量表法的Bepipred 1.0程序，設(shè)定分?jǐn)?shù)閾值為0.35，預(yù)測潛在的B細(xì)胞線性表位[9]；最后，結(jié)合profilin三維結(jié)構(gòu)模型，使用ElliPro程序并設(shè)定最小分值為0.5，進(jìn)一步分析線性表位序列。綜合三種方法所得結(jié)果，選取同時被兩種以上方法斷定為表位的共同序列作為最終線性B細(xì)胞表位結(jié)果。同時，使用Ellipro和SEPPA 3.0兩種工具對大籽蒿花粉profilin的構(gòu)象性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測分析[10-11]，綜合兩種方法所得共同的序列作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大籽蒿花粉profilin基因擴(kuò)增和克隆

大籽蒿花粉總RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，獲得一個大小約為400 bp的片段(圖2)，回收后依次進(jìn)行TA克隆和重組克隆并測序。大籽蒿花粉profilin序列編碼區(qū)含有402個堿基，編碼133個氨基酸(圖1)，前引物和后引物位置用下劃線標(biāo)注。

圖 2 大籽蒿花粉profilin PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 2 PCR amplification of Artemisia sieversiana pollen profilinM:DNA marker DL2000; 1:大籽蒿proflin基因擴(kuò)增

2.2 大籽蒿花粉profilin表達(dá)純化

profilin蛋白以包涵體形式在相對分子質(zhì)量13 000附近表達(dá)(圖3A)。利用重組蛋白C-末端的組氨酸標(biāo)記，在變性條件下使用高親和力的Ni-NTA樹脂對包涵體進(jìn)行純化，使用SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化效果較好(圖3B)，收集的洗脫液梯度透析到PBS中進(jìn)行蛋白復(fù)性。

2.3 大籽蒿花粉profilin ELISA

大籽蒿花粉profilin ELISA以10份陰性血清的吸光度值計算：cut-off值=x+3s，結(jié)果為0.209 7(圖中以虛線標(biāo)出)。50份蒿過敏血清中11份血清的ELISA值高于cut-off值，陽性率為22%(圖4)。

2.4 大籽蒿花粉profilin Western blot

對11份ELISA陽性血清進(jìn)行Western blot分析，一份陰性血清作對照。發(fā)現(xiàn)其中5份血清含有IgE且能與大籽蒿花粉profilin結(jié)合而顯示出陽性條帶(圖5)。

圖 3大籽蒿花粉profilin表達(dá)純化

Fig3Expression and purification ofArtemisiasieversianapollen profilin

A:profilin誘導(dǎo)表達(dá)圖;M.蛋白marker26616;1.未誘導(dǎo)菌;2.誘導(dǎo)菌;3.誘導(dǎo)菌超聲裂解后的上清;4.誘導(dǎo)菌超聲后的沉淀(包涵體);箭頭表示重組profilin

B:profilin純化圖;M.蛋白marker26616;1.誘導(dǎo)菌超聲后的沉淀;2.穿透液;3.50 mmol/L咪唑洗脫液; 4.200 mmol/L咪唑洗脫液;箭頭表示純化profilin

Mr:相對分子質(zhì)量

2.5 大籽蒿花粉profilin保守性分析

通過多重序列比對，大籽蒿花粉profilin與花粉、食物及膠乳中profilin均具有較高序列一致性(圖6)。其中大籽蒿花粉profilin與其近緣物種艾蒿花粉兩個profilin過敏原Art v 4.0101和Art v 4.0201的氨基酸序列一致性最高，分別為86%和99%；與豚草Amb a 8、向日葵Hel a 2、樺樹Bet v 2、橄欖樹Ole e 2、花生Ara h 5、榛子Cor a 2和膠乳Hev b 8的序列一致性分別為81%、85%、70%、76%、69%、72%和70%。圖6比對結(jié)果中方框所示為保守區(qū)序列，黑色高亮區(qū)域為此10種profilin過敏原中100%一致的氨基酸殘基。

圖 4 大籽蒿花粉profilin ELISAFig 4 ELISA of Artemisia sieversiana pollen profilin

圖 5 大籽蒿花粉profilin Western blotFig 5 Western blot of Artemisia sieversiana pollen profilin圖中數(shù)字為患者血清編號，與ELISA中患者血清編號對應(yīng)；NC：陰性血清

圖 6大籽蒿花粉profilin與其他物種中同源過敏原的多重序列比對

Fig6Multiple sequence alignment ofArtemisiasieversianapollen profilin with homologous allergens from other species

2.6 大籽蒿花粉profilin三維模型的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)分析

通過序列相似性比對，艾蒿花粉Art v 4.0101(PDB number：5EM0)與大籽蒿花粉profilin氨基酸序列一致性為86.36%，選擇其模型作為模板對大籽蒿花粉profilin進(jìn)行同源建模(圖7A)。從大籽蒿花粉profilin結(jié)構(gòu)模型的拉氏圖可見91.6%的氨基酸殘基位于偏好區(qū)(most favored regions)，剩余8.4%的氨基酸殘基位于允許區(qū)(圖7B)。通過ERRAT程序分析，模型的綜合品質(zhì)因數(shù)為97.368(圖7C)，并且在Verify3D分析中，99.24%的氨基酸殘基的3D-1D分值≥0.2。另外，模型的Z-score、GMQE和Qvalue分別為-6.74(圖7D)、0.97和-0.24。所有驗證分析均表明通過同源建模所得的大籽蒿花粉profilin的模型立體化學(xué)結(jié)構(gòu)合理、分辨率高、質(zhì)量較好。

模型結(jié)構(gòu)顯示，大籽蒿花粉profilin含有4個α螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于3-10、46-57、63-65和114-131，另外含有7個β折疊結(jié)構(gòu)，分別位于23-29、35-37、67-69、72-76、83-89、92-98和102-108，這些α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)在序列比對結(jié)果中分別以α1～α4和β1～β7標(biāo)示(圖6)。

2.7 大籽蒿花粉profilin B細(xì)胞表位預(yù)測

在DNASTAR軟件中，基于親水性、柔性、表面可及性和抗原性參數(shù)，得到5個線性B細(xì)胞表位；Bepipred 1.0預(yù)測得到4個線性表位；通過Ellipro分析得到7個線性表位。綜合三種工具所得結(jié)果，最終共有5條線性B細(xì)胞表位：17-21, 37-47, 85-91, 109-115, 126-133，并以B1、B2、B3、B4和B5在三維結(jié)構(gòu)中標(biāo)示(圖8A，表1)。

對大籽蒿花粉profilin的構(gòu)象性表位分析中，Ellipro共得出10條構(gòu)象性B細(xì)胞表位。根據(jù)SEPPA 3.0所預(yù)測的表位殘基信息，結(jié)合模型表面結(jié)構(gòu)，得出3條構(gòu)象性表位。綜合Ellipro和SEPPA 3.0的結(jié)果一致區(qū)域，最終獲得3條構(gòu)象性B細(xì)胞表位序列：(13-14)-(16-20), (59-61)-(64), (99-101)-(133)，以CB1、CB2、CB3標(biāo)示于大籽蒿花粉profilin空間結(jié)構(gòu)上(圖8B，表1)。

3 討論

蒿屬以其分布廣泛和花粉產(chǎn)量高的特點，被認(rèn)為是中國最重要的戶外過敏原之一[12]。本研究對大籽蒿花粉的新致敏蛋白組分profilin及其致敏表位進(jìn)行了深入研究。通過多重序列比對，發(fā)現(xiàn)大籽蒿花粉profilin與其近緣物種艾蒿中已報道的兩種profilin具有非常高的保守性，氨基酸一致性分別為86%和99%，另外與花粉、食物及膠乳中profilin的序列一致性也均在65%以上。進(jìn)一步對大籽蒿profilin的免疫學(xué)活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其致敏率為22%，與其他花粉profilin的致敏率相似，如艾蒿Art v 4的致敏率為36%(36/100)[13]，樺樹Bet v 2為22%(55/242)[14]，向日葵Hel a 2為30.5%(37/121)[15]。對11份ELISA陽性血清進(jìn)行Western blot發(fā)現(xiàn)僅有5份血清有條帶?？赡艿脑蚴桥c免疫學(xué)活性相關(guān)的構(gòu)象性表位在Western blot過程中被破壞，提示構(gòu)象性表位在profilin致敏中具有重要作用。

圖 7大籽蒿花粉profilin蛋白三維結(jié)構(gòu)和驗證

Fig7Three dimensional structure of profilin fromArtemisiasieversianapollen and the verification

A:以Cartoon模式展示的三維結(jié)構(gòu);B:三維結(jié)構(gòu)的拉氏圖分析;C:三維結(jié)構(gòu)的綜合質(zhì)量因數(shù)分析;D:B細(xì)胞表位預(yù)測

圖 85個線性表位和3個構(gòu)象性表位在大籽蒿花粉profilin蛋白結(jié)構(gòu)上的位置

Fig8Positions of 5 linear epitopes and 3 conformational epitopes on the structure ofArtemisiasieversianapollen profilin

A:線性表位； B:構(gòu)象性表位

表1 大籽蒿花粉線性表位和構(gòu)象性表位綜合分析Table 1 Linear and conformational epitopes of Artemisia sieversiana pollen profilin

本研究中不僅進(jìn)行了線性表位分析，還對其構(gòu)象性表位進(jìn)行了綜合預(yù)測，得到大籽蒿花粉profilin的5個線性B細(xì)胞表位：17-21, 37-47, 85-91, 109-115, 126-133和3條構(gòu)象性B細(xì)胞表位：(13-14)-(16-20), (59-61)-(64), (99-101)-(133)。從圖8可見，這些表位均位于大籽蒿花粉profilin蛋白表面并且大都分布于蛋白的無規(guī)則卷曲處，并且存在一定的重合性，如線性表位B1是構(gòu)象表位CB1的一部分。另外，先前對向日葵花粉和甜瓜B細(xì)胞表位的研究表明41-48、66-75、81-93、95-99和122-131是profilin過敏原具有交叉致敏性和成為泛過敏原的重要IgE結(jié)合表位[16-17]，與本研究所預(yù)測的大籽蒿花粉profilin的B2、B3和B5三個表位具有一定的保守性。由于本研究所分析的IgE結(jié)合表位均是基于多種工具綜合預(yù)測法，每個表位的具體IgE結(jié)合活性仍需要通過實驗驗證。

總結(jié)來看，本研究發(fā)現(xiàn)大籽蒿花粉profilin與其他花粉、食物及膠乳等多種物種中的profilin過敏原具有非常高的同源性。大籽蒿花粉profilin在蒿屬花粉過敏患者中的致敏率為22%，也與其他花粉過敏原相似。另外，利用同源模擬，構(gòu)建大籽蒿花粉profilin的三維結(jié)構(gòu)模型，得到了5個線性B細(xì)胞表位和3個構(gòu)象性B細(xì)胞表位。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步完善了大籽蒿花粉的致敏原組分信息，還為未來個體化組分解析診斷和低致敏疫苗的研制提供了重要的基礎(chǔ)。