基于魚體和耳石形態(tài)的東海兩種鮐屬魚類判別分析

韓霈武,陳新軍, 3, 4, 5, 6,方 舟, 3, 4, 5, 6,張 衡

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 4.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306; 6. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，上海 201306)

鮐屬(Scomber)魚類隸屬于鱸形目(Perciforms)，鯖科(Scombridae)，是重要的中上層經(jīng)濟(jì)性魚類，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋溫帶及其鄰近海域[1-2]。我國(guó)擁有豐富的鮐屬魚類資源，從20世紀(jì)50年代初期就開始利用燈光圍網(wǎng)捕撈鮐屬魚類，20世紀(jì)80年代，我國(guó)近海底層傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)魚類資源逐漸衰退，到90年代后期，鮐屬魚類已經(jīng)成為我國(guó)近海主要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，年產(chǎn)量約為30萬(wàn)t[3-4]。在我國(guó)近海分布的鮐屬魚類主要有兩種：日本鯖(S.japonicus)與澳洲鮐(S.australasicus)。日本鯖與澳洲鮐在形態(tài)特征和生物學(xué)特性上非常相似，并且它們的洄游路線以及分布范圍存在重疊，這導(dǎo)致二者在分類上存在著許多爭(zhēng)議[5-7]。目前，可以根據(jù)腹部是否存在小黑斑點(diǎn)及背鰭鰭條數(shù)目來(lái)鑒別日本鯖與澳洲鮐，即：日本鯖第一背鰭鰭棘9～10根，體腹部銀白色，一般無(wú)斑點(diǎn)；澳洲鮐第一背鰭鰭棘11～12根，體腹部密布不規(guī)則形小藍(lán)黑斑。但是時(shí)常由于腹部斑點(diǎn)分布的不均勻和背鰭鰭條的損傷，影響到外觀形態(tài)上的區(qū)分結(jié)果。

種類和種群的鑒別是進(jìn)行漁業(yè)資源評(píng)估管理的基本前提[8]。形態(tài)學(xué)方法的特點(diǎn)是快捷簡(jiǎn)便、容易掌握、操作簡(jiǎn)單等，因此廣泛應(yīng)用于多種物種的鑒定。最常見的方法是通過外形測(cè)定來(lái)進(jìn)行差異分析，但以往傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量法會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，同時(shí)所測(cè)量的數(shù)據(jù)也無(wú)法全面地反映魚類的幾何形態(tài)學(xué)信息[9]。框架法(truss)兼有測(cè)量形態(tài)和幾何形態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，它利用魚體的形態(tài)特征，在魚體輪廓邊緣選取一定數(shù)量的點(diǎn)，根據(jù)這些點(diǎn)連接成線，可以把魚體劃分為多個(gè)部分，從而能更全面的包含關(guān)于魚體形狀變化的信息，因此廣泛應(yīng)用于各種研究中[10-11]。耳石是魚類重要的硬組織，具有穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也蘊(yùn)含著重要的生態(tài)信息。目前針對(duì)耳石形態(tài)使用較為廣泛的除了傳統(tǒng)測(cè)量法外，傅立葉分析以其簡(jiǎn)單易懂和可模擬形態(tài)的特點(diǎn)，也得到科研工作者的青睞[12-14]。因此，本研究擬利用框架法和傅立葉分析，對(duì)兩種鮐屬魚類的外形形態(tài)和耳石形態(tài)特征進(jìn)行分析，利用判別分析法比較兩者的正確率，以找到更優(yōu)方法來(lái)有效區(qū)分兩個(gè)種類，為鮐屬魚類資源評(píng)估的種類劃分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究所采用的樣本來(lái)自于東海海域(26°～28°N、122°～124°E)，此區(qū)域?yàn)轷T屬魚類的主要越冬場(chǎng)所，取樣時(shí)間為2017年10月至2018年2月，此階段鮐屬魚類基本在0～1齡，且大多處于成熟期。所有的樣本經(jīng)過冷凍后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解凍處理。本次樣本共203尾，通過腹部斑點(diǎn)及背鰭鰭條數(shù)進(jìn)行綜合判斷，確定其中日本鯖為83尾，澳洲鮐為120尾。樣本基本情況見表1。實(shí)驗(yàn)過程中用鑷子將矢耳石從平衡囊內(nèi)取出，并用水清洗耳石，以去除其表面雜質(zhì)，然后將其放入恒溫烘箱中進(jìn)行干燥，等待后續(xù)備用。

表1 兩種鮐屬魚類的基本信息Tab.1 Sampling information of two Scomber species

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚體形態(tài)測(cè)量

用描述魚體形態(tài)的框架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)在魚體上建立框架。本研究共選定了13個(gè)解剖學(xué)坐標(biāo)(anatomical landmark)，以便獲取鮐屬魚類的框架結(jié)構(gòu)。如圖1所示，運(yùn)用ImageJ軟件，根據(jù)選定的13個(gè)解剖學(xué)坐標(biāo)之間的直線距離，共測(cè)量出26個(gè)框架結(jié)構(gòu)可量性狀(精確到0.001 mm)。

圖1 13個(gè)標(biāo)點(diǎn)所構(gòu)建的鮐屬魚類框架結(jié)構(gòu)測(cè)量圖[15]Fig.1 Locations of 13 landmarks for constructing the truss network of fish (filled circle) and morphometric lengths注：1.吻前端； 2.神經(jīng)顱后側(cè)面(后頸鱗片開始); 3.第一背鰭基部起點(diǎn); 4.第一背鰭基部末端; 5.第二背鰭基部起點(diǎn); 6.第二背鰭基部末端; 7.尾鰭背部起點(diǎn); 8.椎骨柱的后端; 9.尾鰭腹部起點(diǎn); 10.臀鰭基部末端; 11.臀鰭基部起點(diǎn); 12.腹鰭基部起點(diǎn); 13.上頜最后點(diǎn)Note ：1. anterior tip of snout; 2. most posterior aspect of neurocranium (beginning of scaled nape); 3. origin of the first dorsal fin; 4. end of first dorsal fin; 5. origin of second dorsal fin; 6. end of second dorsal fin; 7. dorsal origin of caudal fin; 8. posterior end of vertebrae column; 9. ventral origin of caudal fin; 10. end of anal fin; 11. origin of anal fin; 12. origin of ventral fin; 13. posteriormost point of maxillary

1.2.2 耳石圖像獲取及輪廓提取

將干燥后的耳石放入顯微鏡下進(jìn)行觀察，運(yùn)用Olympus 光學(xué)顯微鏡的10倍鏡頭下的CCD軟件進(jìn)行拍照，所獲得的圖片用于進(jìn)一步分析(圖2)。本實(shí)驗(yàn)均選擇左側(cè)耳石的形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，若有左側(cè)耳石丟失的情況，則選擇右側(cè)耳石替代。通過剔除破損嚴(yán)重的耳石，最終取得日本鯖耳石為71個(gè)，澳洲鮐為81個(gè)。

使用R程序中的“shapeR”加載包[16]對(duì)耳石目標(biāo)進(jìn)行輪廓提取，自動(dòng)讀取兩魚耳石輪廓數(shù)據(jù)，每個(gè)耳石輪廓被讀取為連續(xù)的坐標(biāo)點(diǎn)，共1 000個(gè)，這些坐標(biāo)點(diǎn)通過一系列傅立葉分析方法最后以諧值的形式表現(xiàn)出耳石的輪廓。CAMPANA和CASSELMAN[17]認(rèn)為20組傅立葉諧值就能較為完整地描述和模擬出耳石輪廓。因此，本研究選取20組傅立葉諧值，每組諧值由4個(gè)系數(shù)構(gòu)成，這樣每個(gè)耳石樣本就能得到80個(gè)傅立葉系數(shù)。同時(shí)，由于傅立葉形態(tài)特征值對(duì)圖形化耳石比較敏感(主要在位置、大小和方向等方面)，因此所得出的諧值需要經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，才能應(yīng)用于隨后的數(shù)據(jù)分析中。在標(biāo)準(zhǔn)化的過程中每個(gè)耳石樣本前3個(gè)系數(shù)值均為常數(shù)(A1=1，B1=C1=0) ， 這樣每個(gè)耳石外部輪廓由77個(gè)傅立葉系數(shù)組成，此數(shù)據(jù)將進(jìn)行后續(xù)逐步判別分析。

圖2 兩種鮐屬魚類耳石形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphology of otolith for two Scomber species注：A. 日本鯖；B. 澳洲鮐Note: A. S. japonicus; B. S.australasicus

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 魚體形態(tài)數(shù)據(jù)分析

1)形態(tài)分析應(yīng)不受尺寸的影響，避免對(duì)結(jié)果的誤解。因此，利用相對(duì)生長(zhǎng)測(cè)定法[18](allometric method)對(duì)每條魚的26個(gè)可量性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：

Madj=M(Ls∕Lo)b

式中，Madj為可量性狀標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)；M為各可量性狀標(biāo)準(zhǔn)化前的數(shù)據(jù)；Ls為本樣品叉長(zhǎng)的平均值；Lo為各種類個(gè)體的叉長(zhǎng)；b為每個(gè)樣本的lgM對(duì)lgLo斜率。

2)t檢驗(yàn)。運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)兩種鮐屬魚類的26個(gè)可量性狀分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，根據(jù)P值的大小來(lái)判斷它們是否存在差異[11]。

3)逐步判別分析(stepwise discriminant analysis, SDA)。利用SPSS17.0軟件中的逐步判別分析方法建立兩種鮐屬魚類的判別公式：

判別準(zhǔn)確率計(jì)算如下：

綜合判別率計(jì)算如下：

式中，Pa為判別準(zhǔn)確率;Pc為綜合判別率;A是指該分組所測(cè)量的實(shí)際個(gè)體數(shù);B是指被判為該分組的個(gè)體數(shù);Ai是指第i個(gè)分組中判別正確的個(gè)體數(shù);Bi是指第i個(gè)分組的實(shí)際個(gè)數(shù);n為分組數(shù)。

1.3.2 耳石形態(tài)數(shù)據(jù)分析

首先將耳石外部輪廓所測(cè)得的77個(gè)系數(shù)用Levene’s法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，去除非齊性的參數(shù)，然后進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，隨后將剩余的參數(shù)進(jìn)行逐步判別分析(SDA)，挑出適合的因子，建立判別函數(shù)，并計(jì)算判別正確率和總的正確率，計(jì)算公式同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于框架測(cè)量法的外形分析

2.1.1 兩種鮐屬魚類可量性狀的初步比較

表2列舉了日本鯖與澳洲鮐經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后的可量性狀方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過比較日本鯖與澳洲鮐的平均值，可以得出兩種魚類在4-5、11-12、1-12、3-11、3-10、4-11和4-10中的值相差較大(≥10.00)，且日本鯖的值均小于澳洲鮐的值；在7-8、8-9、10-11、13-1和7-9中的值相差較小(≤3.00)。

對(duì)26個(gè)可量性狀進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兩種魚類在10-11中差異不顯著，在其余的可量性狀中差異極顯著。

2.1.2 基于外形參數(shù)對(duì)兩種鮐屬魚類的判別分析

通過逐步判別分析進(jìn)行分類，運(yùn)用Wilks’Lambda法對(duì)26個(gè)可量性狀進(jìn)行篩選，最終選擇了4個(gè)可量性狀(1-2、10-11、2-11和3-11)來(lái)對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行分類。以這4個(gè)可量性狀為自變量建立判別函數(shù)，具體如下：

日本鯖：

Y=2.895X1-0.051X2+2.029X3-0.237X4-187.301

澳洲鮐：

Y=3.125X1-0.248X2+2.279X3-0.051X4-248.182

將兩種鮐屬魚類的可量性狀分別代入上述判別函數(shù)中，得到兩個(gè)函數(shù)值Y。其中判別函數(shù)中哪個(gè)函數(shù)值Y最大，則其對(duì)應(yīng)的種類便是該樣本所屬的種類。從判別的結(jié)果來(lái)看，在初始判別中，日本鯖的判別正確率為85.40%，澳洲鮐的判別正確率為89.20%，總體正確率為87.60%。經(jīng)過交叉驗(yàn)證得出的結(jié)果與初始判別結(jié)果近似，日本鯖與澳洲鮐的判別正確率分別為82.90%和88.30%，總體正確率為86.70%(表3)。

表2 日本鯖與澳洲鮐可量性狀之間的比較Tab.2 Comparison of morphometric characteristics of S. japonicas and S. australasicus

注：P<0.01為差異極顯著；P<0.05為差異顯著；P>0.05為無(wú)顯著差異

Note：P<0.01 means extremely significant differences；P<0.05 means significant differences；P>0.05 means no significant difference

2.2 傅里葉分析

2.2.1 耳石形態(tài)特征與重構(gòu)

兩個(gè)物種的平均耳石示意圖如圖3所示。兩種鮐屬魚類耳石總體輪廓呈瓦狀，耳石前端基葉長(zhǎng)而尖，翼葉寬而短；耳石的背側(cè)凹陷，腹側(cè)則比較平直；耳石后端寬大，較為平滑。耳石前端比較開闊，中間窄，后端又逐漸變寬，達(dá)到最寬。

比較兩種鮐屬魚類耳石，可以看出日本鯖與澳洲鮐的耳石形態(tài)存在一定的差異。其中，日本鯖的耳石略小于澳洲鮐，在耳石后端(0～90°和270～360°)尤為明顯。澳洲鮐在耳石約30～60°和300～330°的部位，顯得更為寬大(圖3)。

圖3 基于傅立葉分析的兩種鮐屬魚類耳石模擬平均形態(tài)示意圖Fig.3 Simulation of mean otolith morphology for two Scomber species based on Fourier analysis

2.2.2 判別分析

用逐步判別分析對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行分類，通過正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，將剩余入選的因子用Wilks’Lambda法進(jìn)行篩選，最終選擇了7個(gè)參數(shù)(V8、V20、V24、V25、V32、V37、V40)來(lái)對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行分類。以這7個(gè)參數(shù)為自變量建立判別函數(shù)，具體如下：

日本鯖：

Y=175.275×V8+4 613.253×V20+8 149.713×V24+4 349.258×V25+10 084.571×V32+7 846.587×V37+159 845.258×V40-2 910.117

澳洲鮐：

Y=220.534×V8+4 767.894×V20+8 199.587×V24+4 158.658×V25+10 254.627×V32+7 549.861×V37+160 158.439×V40-2 957.456

將兩種鮐屬魚類樣本所挑選出的傅里葉諧值分別代入上述判別函數(shù)中，得到兩個(gè)函數(shù)值Y。其中判別函數(shù)中哪個(gè)函數(shù)值Y最大，則其對(duì)應(yīng)的種類便是該樣本所屬的種類。從判別的結(jié)果來(lái)看，所得的總正確率均比框架測(cè)量法所得的總正確率高。在初始判別中，日本鯖的判別正確率為91.50%，澳洲鮐的判別正確率為93.80%，總體正確率為92.40%。經(jīng)過交叉驗(yàn)證得出的結(jié)果與初始判別結(jié)果近似，日本鯖與澳洲鮐的判別正確率分別為87.30%和91.30%，總體正確率為90.20%(表4)。

3 討論

3.1 可量性狀初步比較分析

傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量法對(duì)魚體的形態(tài)描述主要是通過對(duì)魚體的頭部、尾部和橫縱方向進(jìn)行測(cè)量分析，但是這些測(cè)量并不能全面的包含關(guān)于魚體形狀變化的信息，因而不能有效地區(qū)分不同魚類的形態(tài)差異[19-20]。而框架測(cè)量法則能克服這一缺點(diǎn)，利用魚體的形態(tài)特征，在魚體輪廓邊緣選取一定數(shù)量的點(diǎn)，根據(jù)這些點(diǎn)連接成線，可以把魚體劃分為多個(gè)部分，從而更能全面的包含關(guān)于魚體形狀變化的信息。目前，海薩等[21]利用框架測(cè)量法對(duì)鱸屬魚類進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示伊犁鱸(Percaschrenki)與黃金鱸(P.flavescens)和河鱸(P.fluviatilis)在形態(tài)上有較大的差距，從而表明了相對(duì)于傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量法，框架測(cè)量法更加適用于魚類的形態(tài)學(xué)研究；孟立霞[22]利用框架測(cè)量法對(duì)雅礱江5種裂腹魚類進(jìn)行形態(tài)學(xué)差異研究,結(jié)果表明這5種裂腹魚類存在顯著的形態(tài)學(xué)差異，可以被有效辨別，也證實(shí)了框架測(cè)量法的優(yōu)越性。

表4 基于傅里葉分析的兩種鮐屬魚類判別分析結(jié)果Tab.4 Result of classification between S. japonicas and S. australasicus based on Fourier analysis by SDA

唐啟升[3]認(rèn)為：每年春季，鮐魚從東海南部的越冬場(chǎng)向浙江近海的產(chǎn)卵場(chǎng)做生殖洄游，性發(fā)育成熟的個(gè)體就地產(chǎn)卵，產(chǎn)卵結(jié)束后游向外海索餌，夏末秋初鮐魚一般位于東海北部和黃海南部。而春季性腺未發(fā)育成熟的鮐魚繼續(xù)北上。春末夏初，鮐魚進(jìn)入黃海產(chǎn)卵，產(chǎn)卵結(jié)束后在當(dāng)?shù)厮黟D，度過夏季和秋季。秋末，鮐魚南下洄游，冬季返回越冬場(chǎng)。本文采用框架測(cè)量法對(duì)東海南部的兩種鮐屬魚類的形態(tài)差異進(jìn)行研究，并利用相對(duì)生長(zhǎng)測(cè)定法來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而消除異速生長(zhǎng)對(duì)結(jié)果的影響。研究表明，在26個(gè)可量性狀數(shù)據(jù)的平均值中，有超過一半的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析中存在差異，這些數(shù)據(jù)均表明日本鯖與澳洲鮐在形態(tài)上存在著明顯的差異。在這些可量性狀中，差異主要集中在魚的頭部與軀干部。日本鯖的頭部和軀體部分均小于澳洲鮐。頭部的差異可能是受到食性和攝食行為的影響[23]，鮐屬魚類具有鰓耙和牙齒，既可以攝食浮游動(dòng)物又可以捕食魚類等其他動(dòng)物，但其攝食的種類及比重有所差異[4]。軀干部的差異有可能與游泳活動(dòng)能力強(qiáng)弱相關(guān)，兩種鮐屬魚類棲息水層的不同可能影響了它們的游泳能力。

對(duì)26個(gè)可量性狀進(jìn)行逐步判別分析，最終選定了4個(gè)可量性狀來(lái)對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行分類。這4個(gè)可量性狀包含了魚的頭部(1-2)和軀干(10-11、2-11、3-11)，從而對(duì)鮐屬魚類形態(tài)進(jìn)行判別分析。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，利用框架測(cè)量法對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行判別分析是有效可行的。這一結(jié)果與邵峰等[24]對(duì)東黃海鮐屬魚類形態(tài)差異研究結(jié)果相符合。因此東海兩種鮐屬魚類在形態(tài)上差異明顯，且不同部位的差異也各有所不同。

3.2 傅里葉分析

耳石是魚類在生長(zhǎng)過程中沉積在內(nèi)耳的結(jié)石，主要成分為碳酸鈣，對(duì)魚類聲音接收和平衡定向起著重要的作用。隨著魚類的生長(zhǎng)，耳石也不斷地生長(zhǎng)，且一旦形成一定的形狀，就很少會(huì)發(fā)生吸收、變形和分解的現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于不同種類的魚類耳石形態(tài)鑒別中[25-29]。從形態(tài)上看，日本鯖的耳石與澳洲鮐的耳石存在著一定的差異，尤其是在耳石后端部分(圖3)。目前針對(duì)耳石形態(tài)較為廣泛使用的除了傳統(tǒng)測(cè)量法外，傅立葉分析以其簡(jiǎn)單易懂和可模擬形態(tài)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種種類鑒別中。方舟等[12]利用傳統(tǒng)形態(tài)測(cè)量法與傅立葉分析對(duì)西非沙丁魚(Sardinapilchardus)和金色沙丁魚(Sardinellaaurita)的耳石形態(tài)差異進(jìn)行分析，結(jié)果能很好地對(duì)種類進(jìn)行區(qū)分，并且發(fā)現(xiàn)傅立葉分析法更加準(zhǔn)確、可靠。本研究是利用傅立葉分析對(duì)兩種鮐屬魚類進(jìn)行判別分析，從結(jié)果來(lái)看，初始判別的正確率大于90%，經(jīng)交叉驗(yàn)證后，判別率略微減少，但也高于85%。初始判別分析與交叉驗(yàn)證的總正確率近似，均大于90%。

由此可見，利用框架測(cè)量法對(duì)兩種鮐屬魚類的判別分析與耳石的傅立葉分析結(jié)果一致，均表明日本鯖與澳洲鮐差異明顯。值得一提的是，利用傅立葉分析得出的判別總正確率比基于框架測(cè)量法的判別總正確率提高了3%～5%，這可能是由于魚體在捕撈、運(yùn)輸過程中受到一定的損壞，而耳石是在魚體內(nèi)部，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易遭到破壞，這也說明了耳石作為判別材料的可靠性。

4 小結(jié)

本文采取框架法對(duì)魚體形態(tài)進(jìn)行判別分析，再采取耳石的傅立葉分析進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明這兩種方法都適用于鮐屬魚類鑒別，同時(shí)傅立葉方法對(duì)耳石的判別分析比框架測(cè)量法在判別正確率上有所提升，說明耳石傅立葉分析可以更好地用于魚類種類判別，可以在今后的研究中進(jìn)行推廣。在今后的研究中，可利用框架法對(duì)不同種類的魚進(jìn)行鑒別并結(jié)合耳石的傅立葉分析進(jìn)行驗(yàn)證，從而使結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)、準(zhǔn)確。