擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因克隆及其在鹽度脅迫下的表達(dá)分析

刁 樂，張鳳英，宋 煒，馬春艷，王 偉，諶 微，馬凌波，趙 明，喬振國(guó)，蔣科技

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090； 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

鹽度對(duì)水生甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝等具有極其重要的影響[1-2]，水生甲殼動(dòng)物Na+/H+-exchanger向膜內(nèi)和膜外分別轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和H+[3-5]，維持胞內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)，對(duì)廣鹽性蟹類在低鹽環(huán)境下的Na+攝入具有重要影響[6-11]。擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda) ，甲殼綱(Crustacea) ，十足目(Decapoda)，短尾亞目(Brachyura) ，梭子蟹科(Portunidae)，青蟹屬，廣泛分布于我國(guó)東南沿海地區(qū)[12-13]，是我國(guó)重要的海水捕撈和養(yǎng)殖品種。擬穴青蟹幼體在27～35鹽度條件下都能正常發(fā)育成仔蟹，但在鹽度27時(shí)的成活率和生長(zhǎng)情況最好[14-16]。隨著個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，擬穴青蟹具有逐步趨向低鹽環(huán)境生活的習(xí)性[17-18]。擬穴青蟹幼體相比仔蟹更易遭受鹽度改變帶來的影響[17]，幼體培育階段的鹽度環(huán)境往往直接影響育苗的成活率，其中大眼幼體變態(tài)期是幼體培育過程中死亡率最高的階段[17-18]。當(dāng)前海水經(jīng)濟(jì)蟹類中，擬穴青蟹苗種規(guī)模化繁育技術(shù)還未完全成熟，其中一個(gè)關(guān)鍵因素就是目前擬穴青蟹幼體階段鹽度脅迫的研究很少，缺乏相應(yīng)的調(diào)控思路與方法。

水生甲殼動(dòng)物中，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[5]、普通濱蟹(Carcinusmaenas)[19]、中國(guó)明對(duì)蝦(Penaeuschinensis)，麥龍螯蝦(Cheraxtenuimanu)[20]、天空藍(lán)魔(Cheraxdestructor)[20]和紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)[21]等已見Na+/H+-exchanger基因的相關(guān)報(bào)道。馬金武等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Na+/H+-exchanger基因主要在三疣梭子蟹的鰓組織中特異性表達(dá)，在低鹽中起作用，在高鹽中的作用不明顯。XU等[22]報(bào)道了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的部分序列，但未報(bào)道Na+/H+-exchanger的表達(dá)情況。本研究克隆獲得擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)該基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析該基因在不同組織和不同幼體時(shí)期的表達(dá)變化，同時(shí)研究擬穴青蟹大眼幼體時(shí)期鹽度脅迫下Na+/H+-exchanger的表達(dá)情況。以期為廣鹽性甲殼動(dòng)物Na+/H+-exchanger基因滲透調(diào)節(jié)機(jī)理的研究、擬穴青蟹耐低鹽新品系的選育等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬穴青蟹幼體取自海南瓊海東海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地，不同幼體分期為受精卵(F.egg)、溞狀幼體I～V(Z1～Z5)、大眼幼體(M)、一期仔蟹(C1)和二期仔蟹(C2)，加無(wú)液氮型樣品RNA保存液(生工生物工程有限公司)凍至-80℃保存?zhèn)溆?。成體購(gòu)買于中國(guó)海南省文昌市環(huán)球碼頭，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室水循環(huán)系統(tǒng)提前養(yǎng)殖一周。

1.2 擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長(zhǎng)克隆

前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的核心序列，提取成體雌蟹的神經(jīng)節(jié)組織構(gòu)建5′-RACE和3′-RACE cDNA文庫(kù)，在預(yù)測(cè)的ORF區(qū)設(shè)計(jì)RACE特異性引物，進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到該基因全長(zhǎng)cDNA序列。RACE使用Clontech公司(TAKARA，中國(guó)大連)的SmartTM Race cDNA Amplification kit試劑盒，按照使用說明書進(jìn)行操作。5′-RACE 的特異性引物為Sp-NHE-F(AGACCACCAGATACCACCGA)，3′-RACE的特異性引物為Sp-NHE-R(ACCTCCAATCCCCAAAC

CTTAC)，另一方向引物為試劑盒自帶通用引物。

RACE產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將目的條帶進(jìn)行割膠回收，克隆到pMD19-T載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆送至上海杰李生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接獲得Na+/H+-exchanger的cDNA全長(zhǎng)。除試劑盒提供的引物外，其他引物委托上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用ORF Finder(http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框并翻譯，在Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)分析從而對(duì)基因進(jìn)行初步注釋。利用ExPASy(http://au.expasy.org/drug_design)分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。

在UniPortKB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載多個(gè)物種的Na+/H+-exchanger序列，所使用的序列包括：三疣梭子蟹A0A286QYA6、普通濱蟹Q23706、中國(guó)明對(duì)蝦A0A286QYA6、麥龍螯蝦A0A0C5DFF2、天空藍(lán)魔A0A0C5DNU5、紅螯螯蝦A0A0C5DNU5、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)Q8MQP4、埃及伊蚊 (Aedesaegypti)Q7Z0L7、中華按蚊(Anophelessinensis)A0A084VYE0、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)Q5TNB1、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)I3J5H3、斑馬魚(Daniorerio)F1R610、雀鱔(Lepisosteusoculatus)W5MNT3、智人(Homosapiens)Q14940、小白鼠(Musmusculus) B2RXE2。

使用 DNAMAN 軟件對(duì)部分物種的Na+/H+-exchanger氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，使用MEGA7的clustalW對(duì)16條Na+/H+-exchanger序列進(jìn)行比對(duì)，鄰接法構(gòu)建發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)置為1 000。采用ORF Finder進(jìn)行基因開放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)，采用Blast程序分析目的基因與其他物種的相似度，使用DNAMAN軟件進(jìn)行基因編碼氨基酸序列的多重序列比對(duì)。使用ProtParam tool、SMART、TMHMM Server v. 2.0和ProtScale等在線生物信息分析工具對(duì)基因編碼蛋白的基本物理性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和親、疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.4 Na+/H+-exchanger基因的組織表達(dá)分析和時(shí)空分布分析

提取成體蟹的腦神經(jīng)節(jié)、鰓、心臟、中腸、卵巢(卵巢發(fā)育I期)、納精囊、精巢、胸神經(jīng)節(jié)組織，以及從受精卵到仔蟹Ⅱ期不同幼體發(fā)育時(shí)期樣本的總RNA，使用DNAase I處理后反轉(zhuǎn)錄用于Na+/H+-exchanger的表達(dá)分析。RNA提取使用北京艾德萊生物技術(shù)有限公司的總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄使用TOYOBO的熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒參考說明書進(jìn)行。熒光定量使用試劑為TAKARA公司的SYBR green PCR master mix(TAKARA，大連)。反應(yīng)體系和程序參考本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[23]，反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，SYBR Primix ExTaq5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s， 40 個(gè)循環(huán); 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。

由于18S rRNA在擬穴青蟹的多種不同樣本中能穩(wěn)定表達(dá)，適合作為擬穴青蟹基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。本文使用18S作為內(nèi)參基因[24]，Na+/H+-exchanger的特異性引物為Sp-NHE-RTF(TGTGATGTGTTACGGAGGGC)和Sp-NHE-RTR(AAACCATGGCGATAGTGGCA)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析計(jì)算檢測(cè)Na+/H+-exchanger基因在各個(gè)樣本中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 擬穴青蟹大眼幼體在不同鹽度脅迫下對(duì)Na+/H+-exchanger的表達(dá)調(diào)控分析

實(shí)驗(yàn)所用為擬穴青蟹大眼幼體3日齡，實(shí)驗(yàn)設(shè)置鹽度7、17和37試驗(yàn)組和自然海水對(duì)照組(鹽度27)，保持溫度與養(yǎng)殖池溫度一致，每組約40只幼體，鹽度37試驗(yàn)組水體由自然海水與鹵水混勻調(diào)制，鹽度7和17試驗(yàn)組水體由自然海水與滅菌處理后的自來水(滅菌處理程序與養(yǎng)殖池海水處理程序一致)混勻調(diào)制，實(shí)驗(yàn)前水體充分曝氣。各鹽度組分別在實(shí)驗(yàn)20 min、1 h、2 h和6 h時(shí)取樣，放于無(wú)RNA酶離心管中，標(biāo)記編號(hào)后置于RNA保存液中冷凍保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+/H+-exchanger基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

本研究采用RACE技術(shù)克隆獲得了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的全長(zhǎng)(GenBank 接收號(hào)：MK408672)，cDNA全長(zhǎng)3 624 bp(圖1)，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)2 886 bp。ORF編碼氨基酸961個(gè)，預(yù)測(cè)蛋白分子量為107.1 kDa，理論等電點(diǎn)為6.90。

通過氨基酸序列多重比對(duì)分析表明，Na+/H+-exchanger氨基酸序列在60～660氨基酸區(qū)段內(nèi)保守性較高。SMART分析預(yù)測(cè)表明該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域包括: Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(82～484)、信號(hào)肽 (0～21)和4個(gè)低復(fù)雜結(jié)構(gòu)(23～42、 675～684、855～868和889～902)。TMHMM和ProtScale在線工具分析表明，Na+/H+-exchanger基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，主要分布于0～487氨基酸區(qū)段，該區(qū)段內(nèi)親、疏水性氨基酸均有分布，488～951氨基酸編碼蛋白無(wú)跨膜區(qū)段，位于膜內(nèi)，呈親水性。

2.2 Na+/H+-exchanger基因的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因編碼氨基酸序列與三疣梭子蟹、中國(guó)明對(duì)蝦、普通濱蟹、麥龍螯蝦、天空藍(lán)魔和紅螯螯蝦的一致度分別為84.9%、62.7%、56.5%、53.7%、53.5%和52.1%(圖2)。利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明，脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物Na+/H+-exchanger遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，埃及伊蚊等昆蟲類聚為一支，擬穴青蟹同三疣梭子蟹親緣關(guān)系最近，并同中國(guó)明對(duì)蝦等聚為一支(圖3)。

2.3 Na+/H+-exchanger基因時(shí)空表達(dá)分析

利用qRT-PCR檢測(cè)Na+/H+-exchanger基因在擬穴青蟹成蟹不同組織中的表達(dá)情況。組織分布分析表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger在卵巢中表達(dá)量最高，其次是精巢、鰓、中腸、胸神經(jīng)節(jié)、心臟、納精囊，腦神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量最低(圖4)。除性腺組織外，其他組織表達(dá)情況與三疣梭子蟹和普通濱蟹在Na+/H+-exchanger基因上的研究結(jié)果基本一致。在幼體發(fā)育過程中，Na+/H+-exchanger基因在受精卵時(shí)期表達(dá)量最高，大眼幼體期次之。溞狀幼體Ⅱ期(Z2)最低，從受精卵期到溞狀幼體Ⅱ期(Z2)逐漸降到最低。然后隨著發(fā)育逐漸升高，到大眼幼體期(M)再次達(dá)到較高值，之后逐漸下降(圖5)。

圖1 擬穴青蟹 Na+/H+-exchanger的cDNA全長(zhǎng)及其翻譯的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of Na+/H+-exchanger from Scylla paramamosain注：方框內(nèi)為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；* 代表終止密碼子；黃色陰影所示為熒光定量引物結(jié)合位點(diǎn)；陰影部分分別是信號(hào)肽(0～21)和Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(82～484)Note: The starting codon(ATG) and the stop codon (TAG) are in the box; * stands for termination codon; the yellow shadow regions are the binding sites of fluorescence quantitative primers; the shadow regions are signal peptide(0-21) and Na+/H+-exchanger domain(82-484)

圖2 Na+/H+-exchanger氨基酸序列與其他物種Na+/H+-exchanger的序列比對(duì)Fig 2 Na+/H+-exchanger amino acid sequence compared with Na+/H+-exchanger of other species注：黑色下劃線標(biāo)注為預(yù)測(cè)的Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域Note: Na+/H+-exchanger domain is underlined

圖3 基于Na+/H+-exchanger氨基酸序列的物種NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 3 Phylogram based on neighbor-joining tree of species of Na+/H+-exchanger amino acid sequences

圖4 Na+/H+-exchanger基因在不同組織中的表達(dá)Fig 4 Tissue distribution analysis of Na+/H+-exchanger注： Cg：腦神經(jīng)節(jié);Gi：鰓;H：心臟;Mi:中腸;Ov:卵巢;Sr:納精囊;Te:精巢;Tg:胸神經(jīng)節(jié)Note: Cg： cephalic ganglion;Gi: gill;H: heart; Mi: midgut;Ov: ovary;Sr: seminal receptacle;Te: testes;Tg: thoracic ganglion

2.4 Na+/H+-exchanger基因在不同鹽度脅迫下的表達(dá)分析

鹽度7、17和37試驗(yàn)組和養(yǎng)殖塘自然海水對(duì)照組(鹽度27)的測(cè)定結(jié)果表明，鹽度從27驟降至7和17時(shí)，7和17試驗(yàn)組Na+/H+-exchanger基因的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。在1 h和2 h期間，鹽度7和17試驗(yàn)組Na+/H+-exchanger基因的表達(dá)水平明顯下降，此時(shí)已有足夠的蛋白產(chǎn)物，推測(cè)這是此時(shí)其表達(dá)水平降低的原因；而6 h時(shí)，鹽度7和17試驗(yàn)組Na+/H+-exchanger基因的表達(dá)水平基本恢復(fù)正常，說明幼體已適應(yīng)這種鹽度環(huán)境。鹽度37試驗(yàn)組在20 min時(shí)Na+/H+-exchanger基因先下降，在1～2 h期間逐漸恢復(fù)至正常表達(dá)水平，但到6 h時(shí)其表達(dá)水平再次下降(圖6)。

圖5 Na+/H+-exchanger基因在不同發(fā)育階段中的表達(dá)Fig 5 Expression pattern of Na+/H+-exchanger during different larval development stages注: F. egg: 受精卵；Z1～Z5：溞狀幼體I-V；M: 大眼幼體；C1:一期仔蟹；C2：二期仔蟹Note: F. egg: fertilized eggs；Z1-Z5: five developmental phases of the zoea stage；M: megalopa stage；C1: the early juvenile crab；C2: the second juvenile crab

圖6 鹽度脅迫下Na+/H+-exchanger基因在擬穴青蟹大眼幼體期的表達(dá)情況Fig 6 Expression of Na+/H+-exchanger gene in the megalopae of Scylla paramamosainunder salinity stress

2.5 Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域的比較分析

通過SWISS-MODEL在線程序?qū)M穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(82～484/961)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析，以智人Na+/H+antiporter的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(PDB: 4cza.1.A)為模板預(yù)測(cè)擬穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與三疣梭子蟹(A0A286QYA6) Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(84～486/986)、斑馬魚(F1R610)Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(100～505/970)和黑腹果蠅(Q8MQP4) Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(199～603/999) 的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析(圖7)。

結(jié)果表明，擬穴青蟹、三疣梭子蟹、斑馬魚Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域與黑腹果蠅Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域相比較更為保守，說明Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域的保守性基本符合生物進(jìn)化規(guī)律，但也受物種生物特性及生活環(huán)境等影響，總體而言，Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域在這些海洋動(dòng)物間是高度保守的。

圖7 擬穴青蟹Na+/H+-exchanger domain (A)、三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger domain (B)、斑馬魚Na+/H+-exchanger domain (C)和黑腹果蠅Na+/H+-exchanger domain (D)蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig 7 Three-dimensional structure models of Na+/H+-exchanger domain from Scylla paramamosain (A), Portunus trituberculatus (B),Danio rerio (C) and Drosophila melanogaster (D)

3 討論

本研究首次克隆得到擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長(zhǎng)，可編碼961個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與三疣梭子蟹一致性最高，達(dá)到84.9%，這一結(jié)論印證了擬穴青蟹與三疣梭子蟹同屬梭子蟹科且具有相似生存環(huán)境和生活習(xí)性的特點(diǎn)，與PéQUEUX[2]提出的地域分布對(duì)生物滲透調(diào)節(jié)能力具有重要影響的結(jié)論一致。SMART在線結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域(82～484)，充分證明該基因?yàn)閿M穴青蟹Na+/H+-exchanger基因。通過SWISS-MODEL在線程序?qū)M穴青蟹等物種的Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果也表明Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域在這些海洋動(dòng)物間是高度保守的。TMHMM和ProtScale在線工具預(yù)測(cè)表明0～487氨基酸區(qū)段具有12個(gè)跨膜α螺旋，與擬穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域重疊，且該區(qū)段內(nèi)親疏水性氨基酸均有分布，推測(cè)該區(qū)段可能與離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)[21]。此外，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger符合遺傳進(jìn)化規(guī)律。

利用RT-qPCR分析表明擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的表達(dá)具有組織特異性，除性腺組織外與三疣梭子蟹和普通濱蟹Na+/H+-exchanger基因的研究結(jié)果基本一致[5,19]，但三疣梭子蟹與普通濱蟹目前沒有Na+/H+-exchanger基因在性腺組織表達(dá)的分析研究報(bào)道。本文首次在梭子蟹科探究該基因在性腺組織的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該基因在擬穴青蟹性腺相關(guān)組織(卵巢、精巢和納精囊)表達(dá)量較高，其中卵巢和精巢表達(dá)顯著高于鰓。鹽度的變化會(huì)直接影響擬穴青蟹變態(tài)和蛻殼周期與成功率，水環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是擬穴青蟹產(chǎn)卵和發(fā)育的必要條件，這個(gè)過程中Na+/H+-exchanger基因可能扮演著重要的作用。

鹽度7試驗(yàn)組擬穴青蟹大眼幼體在20 min表達(dá)量顯著高于鹽度17和對(duì)照組(鹽度27)，表明Na+/H+-exchanger基因在較低鹽度環(huán)境下的作用更加明顯。鹽度7和17試驗(yàn)組在1 h表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(鹽度27)，明顯受到抑制，推測(cè)是前期Na+/H+-exchanger基因的高表達(dá)已滿足滲透調(diào)節(jié)作用，此時(shí)已有足夠的蛋白產(chǎn)物。低鹽組(鹽度7和17)在2～6 h，Na+/H+-exchanger基因表達(dá)水平基本恢復(fù)正常，體現(xiàn)了擬穴青蟹大眼幼體有一定低鹽環(huán)境適應(yīng)能力。結(jié)果表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因在鹽度適應(yīng)過程中主要在低鹽脅迫下起作用，且其在低鹽環(huán)境下是一個(gè)快速應(yīng)答的基因，在高鹽環(huán)境中作用不明顯。高鹽組(鹽度37)該基因的表達(dá)在20 min內(nèi)表達(dá)量低于對(duì)照組，推測(cè)是因?yàn)楦啕}度對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生抑制。

本研究探討了鹽度脅迫作用下擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的表達(dá)情況，通過對(duì)擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的克隆、鑒定和表達(dá)分析，初步論述了該基因的序列特征、Na+/H+-exchanger蛋白結(jié)構(gòu)域及其在擬穴青蟹大眼幼體鹽度適應(yīng)過程中的生理作用，為水生甲殼動(dòng)物滲透壓調(diào)控分子機(jī)制提供了理論支撐。