基于線(xiàn)粒體COⅠ基因序列的中國(guó)近海藍(lán)圓鲹遺傳多樣性研究

徐 示，章 群，王業(yè)磷，裴麗梅，羅 純，黃志基

(暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632)

藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi)隸屬鱸形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)圓鲹屬，俗稱(chēng)巴浪、池魚(yú)，主要以浮游甲殼類(lèi)和小型魚(yú)類(lèi)為食，廣泛分布于日本至澳大利亞北部的西太平洋側(cè)，是暖水性中上層魚(yú)類(lèi)。藍(lán)圓鲹在我國(guó)渤海、黃海、東海、南海均有分布，年產(chǎn)量曾一度高達(dá)60萬(wàn)t；魚(yú)肉含高蛋白低脂肪，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[1-2]，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[3-5]。但近年來(lái)，受過(guò)度捕撈和生態(tài)環(huán)境破壞的影響，南海北部一些經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)資源嚴(yán)重衰退以致難以形成漁汛，而據(jù)統(tǒng)計(jì)，藍(lán)圓鲹2004—2009年全國(guó)年均產(chǎn)量約6.2×105t，2010—2018年全國(guó)年均產(chǎn)量約為5.6×105t[6]。為防止藍(lán)圓鲹逐漸向低齡化、小型化和簡(jiǎn)單化等的不利演變，避免重蹈小黃魚(yú)(Larimichthyspolyactis)、大黃魚(yú)(L.crocea)等種質(zhì)資源衰退覆轍，亟待制定相應(yīng)的管理措施，以更好地保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹種質(zhì)資源。

遺傳多樣性是生物多樣性與種質(zhì)資源研究的基礎(chǔ)和核心，遺傳多樣性下降可能導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)力的下降，威脅野外復(fù)雜環(huán)境下物種的生存[7]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)藍(lán)圓鲹的研究主要集中在漁業(yè)資源利用、生理特性、攝食習(xí)性和營(yíng)養(yǎng)級(jí)、形態(tài)特征和部分地區(qū)生物學(xué)分析層面[8-10]。種群遺傳方面的研究，目前僅有牛素芳等[11-12]分別使用控制區(qū)全序列標(biāo)記和Cytb基因標(biāo)記對(duì)福建閩東、閩南2個(gè)群體和南海北部灣海域9個(gè)群體的藍(lán)圓鲹遺傳多樣性分析的報(bào)道，尚未見(jiàn)中國(guó)東海和黃海等海域的研究。

動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)進(jìn)化速度是核基因的4～10倍[13-14]，母系遺傳有效群體數(shù)量?jī)H為核基因的1/4，拷貝數(shù)多，是開(kāi)展種群遺傳研究的首選分子標(biāo)記[15]。其中COⅠ基因已被廣泛用于群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[16-19]，線(xiàn)粒體COⅠ序列也被廣泛用于研究不同階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，如水生生物的群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、物種鑒定[20]等領(lǐng)域。目前已有大量采用COⅠ基因?qū)Σ煌Ｑ笪锓N如藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorusniphonius)[21]、印度明對(duì)蝦(Fenneropenaeusindicus)[22]、日本紅毛蟹(Erimacrusisenbeckii)[23]等進(jìn)行的群體遺傳多樣性研究報(bào)道，藍(lán)圓鲹的線(xiàn)粒體COⅠ基因序列也同樣可很好地用于種群遺傳研究。本研究測(cè)定并分析了中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹10個(gè)地理群體的COⅠ基因序列多樣性，以期更加全面地了解中國(guó)近海藍(lán)圓鲹的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，為種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、DNA提取和測(cè)序

本研究采集了中國(guó)山東、浙江、福建、廣東、廣西、海南6省10個(gè)地理群體193尾藍(lán)圓鲹(表1)，新鮮肌肉樣品保存于95%乙醇備用。DNA提取采用苯酚-氯仿法[24]，用于PCR擴(kuò)增的引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考WARD[25]的實(shí)驗(yàn)方法，將電泳檢測(cè)條帶清晰明亮的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

1.2 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用MEGA X對(duì)測(cè)序峰圖人工校對(duì)，并計(jì)算堿基組成、顛換率，統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)數(shù)，基于Kimura2-Parameter模型的遺傳距離構(gòu)建鄰接樹(shù)。通過(guò)DnaSP 6.12.03軟件計(jì)算單倍型數(shù)(number of haplotypes，Nh)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd )、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)以及遺傳分化系數(shù)(Fst)。使用Network 5.0[26]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)Arlequin 3.5.2.2軟件的分子方差分析(AMOVA)[27]估算群體的遺傳變異，獲得核苷酸錯(cuò)配信息，檢查組別的顯著性差異，計(jì)算Tajima’sD和Fu’sFS值并進(jìn)行中性檢驗(yàn)，得到SSD值、Rg值、τ值參數(shù)[27]。根據(jù)公式T=(τ/2μk)×G，其中，τ、μ、k、T和G依次代表種群擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)、序列的變異速率[采用1%～3%/MY[28](million year, MY)]、序列長(zhǎng)度、代時(shí)以及種群擴(kuò)張時(shí)間。使用 BEAST 1. 8. 2 進(jìn)行種群動(dòng)態(tài)的 Bayesian skyline plot(BSP)分析[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)近海藍(lán)圓鲹群體COⅠ基因序列多態(tài)性

測(cè)序峰圖經(jīng)人工校正并去掉兩側(cè)引物序列后進(jìn)行比對(duì)，在所獲得193條藍(lán)圓鲹COⅠ基因5′端652 bp序列中，A、T、G、C含量分別為22.7%、30.8%、19.7%和26.8%，A+T的含量(53.5%)略高于G+C(46.5%)含量，與其他硬骨魚(yú)類(lèi)的COⅠ堿基特性相一致[30]。在檢測(cè)到62個(gè)變異位點(diǎn)中有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)21個(gè)，轉(zhuǎn)換和顛換比(Ts/Tv)為2.47，表明序列未達(dá)到飽和，適合進(jìn)行種群遺傳發(fā)育分析[31]；29個(gè)單倍型中，22個(gè)為獨(dú)享單倍型，其中共享頻率最高的是Hap_1(106個(gè))，由大部分群體共享；其次是Hap_2(54個(gè))，說(shuō)明二者可能起源于母系祖先的主體單倍型。藍(lán)圓鲹整體呈現(xiàn)高單倍型多樣性(0.626 00±0.030 00)和低核苷酸多樣性(0.002 25±0.001 16)的特點(diǎn)，其中舟山群體的單倍型多樣性、嶗山群體的遺傳多樣性最高，分別為0.771 00和0.005 68；新盈群體兩個(gè)多樣性數(shù)值最低，分別為0.111 00和0.000 17，結(jié)果如表1所示。

2.2 中國(guó)近海藍(lán)圓鲹群體的遺傳分化

以Kimura2-Parameter模型構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)典型的星狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有明顯的地理聚群和譜系結(jié)構(gòu)(圖1)。表2中兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值為-0.040～0.798，其中，北海群體與其他群體Fst值為0.145～0.798且都是極顯著差異；此外，新盈與陵水、惠來(lái)、陽(yáng)江、福州和舟山之間也存在顯著性的遺傳分化(0.006～0.229，P<0.05)[32]。其余組別之間均無(wú)顯著差異，不存在明顯分化。

表1 中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹群體的遺傳多樣性Tab.1 Parameters of genetic diversity of D.maruadsi populations in coastal waters of China

注：DX:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽(yáng)江; HL: 惠來(lái); FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan

表2 中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹10個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)Tab.2 Fixation index (Fst) of 10 D.maruadsi popalations in coastal waters of China

注：X:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽(yáng)江; HL: 惠來(lái); FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan. Statistical significance:*：P<0.05;**：P<0.01;***：P<0.001

按照地理位置將樣品分為下列3組：①10個(gè)地理群體間；②黃海(嶗山)、東海(舟山和福州)、南海(惠來(lái)、陽(yáng)江、北海、東興、新盈、陵水、東方)之間；③臺(tái)灣海峽以北(福州、舟山、嶗山)、臺(tái)灣海峽以南至北部灣之間(惠來(lái)、陽(yáng)江、北海、東興、新盈、陵水、東方)。AMOVA分析(表3)表明：群體內(nèi)的變異達(dá)到81%以上，組群內(nèi)群體間變異比列為16.66%～19.49%。上述3個(gè)分組：10個(gè)群體間(Fst=0.202 50，P<0.001)、3個(gè)不同海域間(Fst=0.301 22，P<0.001)、臺(tái)灣海峽南北之間(Fst=0.185 21，P<0.001)，都顯示出很高的遺傳分化。

2.3 藍(lán)圓鲹的歷史動(dòng)態(tài)

Tajima’sD和Fu’sFS中性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。藍(lán)圓鲹整體Tajima’sD=-1.326 5(P>0.1)，其中北海、東方、陽(yáng)江、舟山4個(gè)群體為顯著性負(fù)值(-2.324 4～-1.684 1，P<0.05)，其余為不顯著性負(fù)值。Fu’sFS檢驗(yàn)東興、惠來(lái)和福州是顯著性負(fù)值(-3.631 6～-2.552 4，P<0.05)，總體上也是顯著性負(fù)值(FS=-1.171 8，P<0.01)。Ramos-Onsins&Rozas’sR2檢驗(yàn)分析顯示Rg值(0.048 6～0.617 3)和SSD值(0.000 1～0.058 2)較小，且均為不顯著性，表明中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹群體沒(méi)有顯著偏離擴(kuò)張模型。此外，核苷酸錯(cuò)配圖(圖2)呈現(xiàn)明顯單峰，且觀測(cè)分布和期望分布擬合優(yōu)度較好；Fu’sFS檢驗(yàn)比Tajima’sD對(duì)群體近期擴(kuò)張更敏感[33]；單倍型網(wǎng)絡(luò)圖呈典型星型結(jié)構(gòu)，表明藍(lán)圓鲹在歷史上經(jīng)歷了明顯的快速擴(kuò)張事件[34]，藍(lán)圓鲹整體擴(kuò)張參數(shù)τ為2.912 5，以線(xiàn)粒體COⅠ基因進(jìn)化速率為(1%～3%)/百萬(wàn)年[28]、性成熟期1年，估算出中國(guó)藍(lán)圓鲹種群擴(kuò)張大約發(fā)生在0.226 30～0.075 44百萬(wàn)年之前，處于晚更新世時(shí)期的末次冰期。BSP進(jìn)一步分析表明，中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹在距今0.21～0.03 Ma BP(圖3)發(fā)生過(guò)快速的種群擴(kuò)張事件，這與公式估算得到的種群擴(kuò)張時(shí)間相吻合。

圖1 藍(lán)圓鲹單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Parsimony network of haplotypes of D.maruadsi注：DX:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽(yáng)江; HL: 惠來(lái); FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。不同的填充形式代表不同的種群，圈的大小表示樣本在不同的單倍型出現(xiàn)的頻率Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan. Different filling traits represent different populations,size of circles is approximately proportional to the frequency of each haplotype

表3 中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹種群結(jié)構(gòu)的分子方差分析Tab.3 AMOVA analysis based on mtDNA differentiation of D.maruadsi in coastal waters of China

注：X:東興; BH:北海; XY:新盈; DF: 東方; LS: 陵水; YJ:陽(yáng)江; HL: 惠來(lái); FZ: 福州; ZS: 舟山; LSh: 嶗山。*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Note: DX:Dongxing; BH:Beihai; XY:Xinying; DF: Dongfang; LS: Lingshui; YJ: Yangjiang; HL: Huilai; FZ: Fuzhou; ZS: Zhoushan; LSh: Laoshan.*：P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

圖2 中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹群體COⅠ核酸不對(duì)稱(chēng)分布Fig.2 Distribution of pairwise differences for mtDNA region haplotypes

3 討論

3.1 藍(lán)圓鲹的遺傳多樣性和歷史動(dòng)態(tài)

遺傳多樣性是在較長(zhǎng)的一段時(shí)間積累下的產(chǎn)物，決定該物種生存、發(fā)展的前景和進(jìn)化的方向[35]。物種適應(yīng)能力、分化能力以及受環(huán)境影響的耐受力很大程度上影響了其遺傳多樣性的高低[36]，而單倍型多樣性(Hd)和核酸多樣性(π)是衡量某一物種遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)。藍(lán)圓鲹COⅠ序列遺傳多樣性(Hd=0.626 00±0.030 00，π=0.002 25±0.001 16)與牛素芳等[12]報(bào)道南海北部的藍(lán)圓鲹(Hd=0.577 00±0.036 00，π=0.001 55±0.001 12)在具體數(shù)據(jù)上略有差異，可能是用于分析的標(biāo)記基因、序列長(zhǎng)度、個(gè)體數(shù)量和地理群體來(lái)源不同所致。但二者都表現(xiàn)為：東部高、西部低。藍(lán)圓鲹多樣性呈現(xiàn)出高Hd低π的特點(diǎn)，這與日本比目魚(yú)(Paralichthysolivaceus)(Hd=0.736 00±0.053 70，π=0.003 29±0.000 58)[37]、藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Hd=0.476 00±0.171 00，π=0.001 90±0.000 70)[21]、黃姑魚(yú)(Nibeaalbiflora)(Hd=0.697 00±0.002 25,π=0.001 72±0.000 21)[38]表現(xiàn)出相同的多樣性分布模式。而黃海和東海等北方群體核苷酸多樣性高于南海群體，則是本研究擴(kuò)大地理范圍所得到的新結(jié)果。

圖3 藍(lán)圓鲹BSP種群動(dòng)態(tài)分析Fig.3 Bayesian skyline plot of D.maruadsi population注：黑線(xiàn)表示中值。陰影區(qū)域表示95%的置信區(qū)間，所有的ESS≥200Note: The black line indicates the median. The shaded portion represents a 95% HPD interval，all ESS values ≥200

一般而言，遺傳變異和分化較低的物種受到各種不利因素的影響后，其恢復(fù)能力較低，甚至?xí)艿綔缃^的風(fēng)險(xiǎn)，反之則能很好地適應(yīng)環(huán)境的變化和有較高進(jìn)化的可能性[39]。北海與其余9個(gè)群體之間存在顯著的遺傳分化(0.145～0.798，表2)，新盈與陵水、惠來(lái)、福州、舟山之間的群體分化也顯著。AMOVA分析結(jié)果顯示，主要變異來(lái)源于群體內(nèi)個(gè)體間(變異比例81.745%～91.680%)外，3個(gè)分組結(jié)果均在組群內(nèi)的群體間有不同程度的遺傳分化(Fst=0.185 21～0.301 22，P<0.001)。藍(lán)圓鲹只在不同季節(jié)做或深或淺的游動(dòng)，而不進(jìn)行長(zhǎng)距離洄游[40]。受南北洋流及大陸架的影響，一方面中國(guó)近海北部的藍(lán)圓鲹隨中國(guó)沿岸流暖流和黑潮穿越臺(tái)灣海峽；另一方面南海南部暖流和中國(guó)沿岸流到達(dá)北部灣，受瓊州海峽和南海大陸架特殊的地理景觀影響[41]，北部灣北海群體和新盈群體難以通過(guò)附近洋流和沿岸流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，因此可能與其他地理群體間遺傳分化明顯。另外，藍(lán)圓鲹在近期整體上發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張事件，推測(cè)在晚更新世時(shí)期的末次冰期，海平面上升，隨著強(qiáng)烈的冬季風(fēng)增強(qiáng)、南海沿岸流上升，地表古生產(chǎn)力(surface paleoproductivity)增加，使得南北部的藍(lán)圓鲹種群得以迅速擴(kuò)張，產(chǎn)生新的變異[42]。中性檢驗(yàn)Tajima’sD檢驗(yàn)法側(cè)重于種群的古老突變，因此此檢驗(yàn)方法能夠反映出較長(zhǎng)跨度時(shí)間范圍內(nèi)所發(fā)生的事件；Fu’sFS中性檢驗(yàn)法對(duì)種群近期事件更為敏感，因此當(dāng)種群在近期積累較多變異時(shí)，F(xiàn)S往往是較大的負(fù)值。本研究中Tajima’sD都是負(fù)值，而藍(lán)圓鲹整體上的Fu’sFS值出現(xiàn)顯著性負(fù)值；單倍型錯(cuò)配分布呈單峰，也說(shuō)明藍(lán)圓鲹可能在歷史上經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張事件。

3.2 藍(lán)圓鲹的種群資源保護(hù)

藍(lán)圓鲹是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，歷史上產(chǎn)量曾長(zhǎng)期位列南海首位，但近年受捕撈強(qiáng)度加大、海洋污染、人為棲息地的破壞和全球氣候變化等多重因素影響，南海藍(lán)圓鲹資源量有所下降，其產(chǎn)量也已退居南海魚(yú)類(lèi)第三位，有可能對(duì)種質(zhì)遺傳資源產(chǎn)生不利影響[43-44]。為避免重蹈大黃魚(yú)種質(zhì)資源衰退以致枯竭覆轍，需要加強(qiáng)藍(lán)圓鲹種質(zhì)資源保護(hù)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用研究。就本研究而言，南海海域的北海和新盈群體與其他群體間存在較高的分化，可作為一個(gè)獨(dú)立的管理保護(hù)單位，其中新盈群體是遺傳多樣性最低的一個(gè)群體，應(yīng)采取措施避免遺傳多樣性的進(jìn)一步降低；其余群體作為另一管理保護(hù)單位，其中黃海海域的嶗山群體核苷酸遺傳多樣性最高，東海海域的舟山群體次之，應(yīng)作為藍(lán)圓鲹種質(zhì)遺傳資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用的核心群體。本研究?jī)H使用母系遺傳的分子標(biāo)記，中國(guó)沿海藍(lán)圓鲹的雙親遺傳和遺傳分化信息并不能完整地反映。在未來(lái)的研究中，將運(yùn)用多個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行分析，同時(shí)擴(kuò)大采樣的范圍和增加采樣的數(shù)量，以期對(duì)中國(guó)近海藍(lán)圓鲹的遺傳背景做更加深入的了解。