玉米根際高效溶磷菌的篩選、鑒定及促生效應(yīng)研究

萬水霞 王靜 李帆 蔣光月 徐文靜 劉祚軍

（1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 安徽養(yǎng)分循環(huán)與資源環(huán)境省級實驗室，合肥 230031；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所， 合肥 230031）

玉米生產(chǎn)在我國糧食生產(chǎn)中占有非常重要的地位。玉米種植生產(chǎn)中主要依賴化學(xué)肥料，但是隨著化肥的不合理施用，玉米品質(zhì)下降、環(huán)境污染、土壤板結(jié)等一系列問題日益突出，嚴(yán)重影響我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［1-2］。隨著農(nóng)業(yè)部化肥零增長減量化行動的實施，減少化肥用量、擴大新型肥料使用成為勢趨。生產(chǎn)實踐證明，利用優(yōu)良促生菌研制的微生物肥料不僅具有肥效作用，還可以減少生產(chǎn)和使用農(nóng)藥、化肥帶來的環(huán)境和食品污染及非再生能源消耗［3-4］。因此，應(yīng)用微生物肥料來替代部分化肥逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的研究熱點。

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料重要的種質(zhì)資源，生存于植物根際或根表，可直接或間接地促進植物生長發(fā)育。部分PGPR 可以通過固氮、溶磷、解鉀、分泌植物激素如吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）等促進植物的生長發(fā)育，還可增強植物對病害、重金屬、鹽堿等逆境的抗性［5-6］。PGPR 在進行生命活動和新陳代謝的過程中，可通過降解土壤中的有機物和難溶性礦物來增加土壤的養(yǎng)分含量。如解磷細(xì)菌可分泌有機酸與部分金屬離子鰲合，將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，供植物吸收，促進植物生長［7］；同時植物生長素IAA 被當(dāng)作篩選PGPR 的重要指標(biāo)，根際促生菌通過分泌IAA 來促進植物合成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而促進植物生長發(fā)育［8］。本研究從大田玉米根際分離篩選兼有溶磷及分泌生長激素的優(yōu)良PGPR 菌株，并利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對其進行分類鑒定，以期為研制復(fù)合微生物肥料提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品分別采自安徽省合肥、肥東、巢湖、桐城的玉米植株根際土壤。用抖落法獲得植物根際土壤，放入無菌封口袋中混勻、封口、編號，裝入冰盒內(nèi)帶回實驗室分離。

培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基用于分離和保存根際細(xì)菌，PKO 培養(yǎng)基用于溶磷菌株的分離與純化［9-11］。 PKO 培 養(yǎng) 基：葡 萄 糖10.0 g、 酵 母 粉0.5 g、 （NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、Ca3（PO4）25.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、補加蒸餾水至1 L，調(diào)節(jié)pH 為 7.0，瓊脂15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 稱取根系土壤配制不同濃度梯度的土壤懸液，分別吸取0.1 mL 懸液涂布培養(yǎng)基平板，每個處理3 次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)5 d。挑取優(yōu)勢菌株，進行純化和多次傳代。

1.2.2 根際溶磷細(xì)菌溶磷能力測定 將篩選出來的細(xì)菌接種于PKO 平板上，30℃ 培養(yǎng)4-6 d，觀察有無溶磷圈產(chǎn)生，測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算溶磷圈與菌落直徑比（D/d）。比值越大，表示溶磷能力越強。將溶磷圈大的細(xì)菌進行液體培養(yǎng)，并設(shè)置空白對照，各處理3 次重復(fù)，30℃，180 r/min 下振蕩培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液離心 10 min（4℃，10 000 r/min），采用鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷的含量，并測定培養(yǎng)液pH 值［12］。

1.2.3 溶磷菌株分泌IAA 特性測定 定性測定：參考Glickman 等［13］的方法，將分離純化的菌株分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中（添加L-色氨酸，使終濃度為0.5 g/L），37℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d，離心后取50 μL 上清液加入等體積Sackowcki’s 顯色劑在白瓷板上避光顯色30 min 后觀察，若出現(xiàn)粉紅色則為陽性，說明該菌株能夠分泌IAA。

定量測定：取陽性菌株的上清液與Sackowcki’s 顯色劑避光顯色30 min 后的混合液，測定在530 nm 的吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對照，以純IAA 的吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各反應(yīng)中的陽性菌株產(chǎn)IAA 的量（μg/mL）［14］。

1.2.4 菌株鑒定 觀察菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色特性，生理生化試驗參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行測定，對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》及相關(guān)文獻鑒定菌株［14-15］。

分別提取菌株的總基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進 行16S rDNA 的PCR 擴增，將PCR 產(chǎn)物送生物工程（上海）有限公司進行測序。測序結(jié)果提交至GenBank，并進行Blast 序列比對分析，使用MEGA 7 軟件通過鄰接（Neighbour-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 盆栽實驗研究溶磷菌株的促生效應(yīng) 盆栽實驗于2019 年5-6 月進行，供試土壤來自安徽懷遠(yuǎn)農(nóng)田，供試作物為莧菜。試驗共設(shè)6 個處理，重復(fù)5 次，分別為：處理1，不接種任何菌劑（CK）；處理2，接種CH07（CH07）；處理3，接種FD11（FD11）；處理4，接種FD13（FD13）；處理5，接種CH07 與FD11 的混合菌劑（復(fù)合1）；處理6，接種CH07、FD11、FD13 的混合菌劑（復(fù)合2）。

供試菌株分別活化后置于LB 培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108CFU/mL（OD600約0.5），采用灌根方式進行接種，接種量10 mL/株。自然條件下室內(nèi)培養(yǎng)，每隔5 d 重復(fù)處理1 次，整個試驗期間保持土壤濕潤，30 d 后收獲植株測定株高及鮮重。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010 和SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用最小顯著差異法（LSD）檢驗進行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 溶磷菌株篩選及其溶磷能力

從安徽不同地區(qū)玉米根際土壤中共分離純化57 株細(xì)菌，其中13 株細(xì)菌具有溶磷功能，能在PKO無機磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生清晰的溶磷圈。其中，5 株來自安徽肥東（菌株標(biāo)號為FD），5 株來自巢湖（菌株標(biāo)號為CH）及3 株來自安徽桐城（菌株標(biāo)號為TC）。根據(jù)溶磷圈與菌落直徑比值的大小可以定性判定溶磷特性的大小。結(jié)果（表1）顯示，菌株FD11、CH07 具有較強的溶磷能力，其 D/d 比值分別為2.05、1.86。

將能產(chǎn)生溶磷圈的13 株菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5 d，測定各菌株對磷酸三鈣的溶解能力，結(jié)果顯示，這3 個樣地中分離的根際促生菌的溶磷能力差異顯著，溶磷量在88.2-368.5 mg/L 之間。其中，發(fā)酵液的有效磷含量最高 的是CH 07菌株，達(dá)368.5 mg/L；其次是FD11 菌株321.5 mg/L、CH09菌株318.9 mg/L。各菌株培養(yǎng)液pH 在4.22-5.69 之間，同時，菌株發(fā)酵液pH 值越低，速效磷含量越高，即各菌株解磷能力與發(fā)酵液pH 值呈現(xiàn)出一定負(fù)相關(guān)，相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

2.2 溶磷菌株分泌IAA 能力分析

利用顯色法和比色法分別對此次篩選中具有溶磷能力的菌株進行分泌生長素（IAA）能力測定，結(jié)果（表2）顯示，6 株菌株具有分泌IAA 的能力。各菌株的顯色反應(yīng)與分泌IAA 的量成正比關(guān)系，即分泌量越大，顏色反應(yīng)越強烈。各菌株IAA 分泌量在14.71-30.95 mg/L。其中，F(xiàn)D03、CH07 菌株分泌IAA 活性顯著高于其他菌株，IAA 產(chǎn)量分別為30.95 mg/L、30.93 mg/L，且菌株FD03、CH07 相互之間差異不顯著。菌株FD11、TC11、CH13、FD07 也具有較強分泌IAA 活性，IAA 產(chǎn)量分別為15.93 mg/L、15.31 mg/L、14.74 mg/L、14.71 mg/L。綜合菌株的溶磷促生特性分析，F(xiàn)D03 菌株雖然分泌IAA 量最高但溶磷活性較弱，故選擇溶磷促生特性均較強的CH07、FD11 菌株作為目標(biāo)功能菌進行下一步研究。

表1 13 株溶磷菌溶磷能力及培養(yǎng)液的pH 值

表2 產(chǎn)IAA 能力的測定結(jié)果

2.3 溶磷菌株鑒定

2.3.1 溶磷菌株菌落形態(tài)、生理生化特征 經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征（圖1），CH07在LB平板上培養(yǎng)24 h后呈圓形不透明，表面光滑，產(chǎn)芽孢，G+，細(xì)胞直桿狀。FD11 在LB平板上培養(yǎng)24 h 后菌落小而致密，干而不透明，幼時表面光滑，邊緣整齊，繼而生長成絨毛狀，表面起粉，G+，細(xì)胞直桿狀。CH07 及FD11 分離物的主要生理生化特征見表3。

圖1 菌株CH07（A）及FD11（B）的菌落形態(tài)和鏡下Gram 染色圖

2.3.2 溶磷菌株16S rDNA 分子學(xué)鑒定 將測序得到菌株的16S rDNA 序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 序列比對，并將序列提交GenBank，獲得CH07 和FD11 登錄號分別為MK474942.1 和MH021963.1。使用MEGA7 軟件，通過鄰接法構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明，菌株CH07 與Bacillus aryabhattai的序列具有最高同源性（圖2-A），菌株FD11 與Streptomyces maritimus的序列具有最高同源性（圖2-B）。

表3 生理生化實驗結(jié)果

圖2 基于菌株CH07（A）和FD11（B）16S rDNA 的neighbor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 盆栽試驗結(jié)果

莧菜種植30 d 后，測定不同處理組莧菜的生長參數(shù)，結(jié)果見表4。接種不同菌株均不同程度地促進了莧菜的生長，其中，復(fù)合菌劑1 對莧菜的促生效果最優(yōu)。從增加莧菜的株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部鮮重方面來看，復(fù)合菌劑1 分別比對照增加14.2%、11.2%、27.7%、59.2%；菌株CH07 促生效果次之，分別比對照增加12.7%、10.9%、20.3%、46.5%；復(fù)合菌劑2 的促生效果最低，分別比對照增加2.24%、0.66%、1.13%、1.34%。復(fù)合菌劑1 及菌株CH07 與CK 相比，除莖粗差異不顯著其他差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。復(fù)合菌劑2 與CK 差異不 顯著。

表4 不同PGPR 菌株處理莧菜生長性狀

3 討論

植物根際促生菌因具有多種有益生物學(xué)作用，成為國內(nèi)外研究熱點。土壤中無機磷約占總磷60%-80%，磷酸鹽中又以鈣鹽為主，因此細(xì)菌解磷酸三鈣的能力可在一定程度上反映出細(xì)菌在土壤中解磷能力的強弱，篩選解磷酸三鈣能力較強的細(xì)菌用于菌肥生產(chǎn)更適合推廣應(yīng)用［10，15］。另外，很多研究者研究發(fā)現(xiàn)溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相關(guān)，溶磷圈的大小并不能完全反映溶磷能力的高低［16-17］。因此，本研究以溶磷圈法作為定性測定，鉬銻抗比色法定量測定，兩者相結(jié)合，來確定菌株的溶磷能力，降低誤差。結(jié)果表明，菌株CH07 溶磷量最高為368.5 mg/L，其次是菌株FD11，溶磷量321.5 mg/L。關(guān)于溶磷量與培養(yǎng)液pH 之間的關(guān)系，之前的研究有不同的結(jié)論。部分研究顯示，細(xì)菌因產(chǎn)酸而具備溶磷能力［18-19］。本研究結(jié)果與之一致，本研究結(jié)果表明溶磷量與溶液pH 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明溶磷與細(xì)菌產(chǎn)酸密切相關(guān)。也有學(xué)者研究認(rèn)為溶磷量與pH之間沒有相關(guān)性［20］，究其原因，主要是由于溶磷菌的溶磷機理多元化所致。對于不同菌株發(fā)酵液中產(chǎn)生有機酸種類、濃度及酸的產(chǎn)生原因有待進一步 研究。

IAA（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）是一種植物生長激素，在一定濃度下能提高農(nóng)作物產(chǎn)量，菌株CH07、FD11 具有產(chǎn)IAA 能力。劉澤平等［21］篩選出的根際促生菌Bacillus ginsengisoliLZP07 IAA 分泌量53.31 mg/L，鄧振山篩選的菌株中有8 株具有分泌IAA 能力，其中菌株XYN-2 能穩(wěn)定分泌IAA 36.61 mg/L［22］。前人的報道顯示高IAA 活性的菌株大多為芽孢桿菌屬，CH07 菌株經(jīng)分子和生理生化試驗鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）IAA 分泌量為30.93 mg/L；FD11 菌株鑒定為鏈霉菌（Streptomyces maritimus）IAA 分泌量為15.93 mg/L。接種莧菜均表現(xiàn)出顯著的促生作用，目前對這2 株菌的抗逆性研究正在進行中。

盆栽試驗結(jié)果證實從玉米根際土壤中篩選出的PGPR，尤其是CH07 及CH07 與FD11 復(fù)合菌劑對莧菜生長有積極作用。CH07、FD11 混合接種優(yōu)于CH07、FD11 或FD13 的單菌接種的促生效應(yīng)。促生菌株以一定比例混合培養(yǎng)，發(fā)揮了各菌株的協(xié)同促生效應(yīng)，此結(jié)果與很多的研究相一致［10，21-22］，但多菌混合，不同菌株之間也會出現(xiàn)相互拮抗的情況。本研究中混合菌劑2 就是由3 種菌混合培養(yǎng)，但該混合菌劑的促生效果相比單一菌株要弱很多，這其中原因可能是3 種菌株混合培養(yǎng)時產(chǎn)生了相互抑制的物質(zhì)。當(dāng)然，促生菌促進作物生長的機理是比較復(fù)雜的，除了與溶磷或分泌IAA 有關(guān)，同時也與促生菌的固氮、分泌其他生長素以及菌株之間的合理比例等因素有關(guān)［23］，本試驗中出現(xiàn)的情況還需進一步探究。

4 結(jié)論

本研究篩選出的2 株根際優(yōu)良促生菌株，CH07、FD11 兼具溶磷、分泌生長素性能，其混合培養(yǎng)的復(fù)合菌劑對莧菜生長有明顯的促進作用。說明CH07、FD11 菌株具有較強植物促生能力，具有開發(fā)利用潛力。研究成果將為微生物菌肥的開發(fā)與生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。