生鮮牛乳體細胞檢測與計量校準必要性研究

楊佳怡 牛春艷 劉瑛穎 傅博強 王晶

（中國計量科學(xué)研究院，北京 100029）

隨著我國人民生活水平的提高，對于生鮮牛乳的需求日益增加。生乳中的體細胞數(shù)是衡量乳品質(zhì)量的重要指標，體細胞數(shù)過高將破壞牛乳中的營養(yǎng)成分，同時提示奶牛乳房炎的發(fā)生。因此，體細胞的數(shù)量將成為牛乳分級的重要依據(jù)之一。利用基于不同原理的方法和不同儀器檢測牛乳中的體細胞數(shù)目，如何保證結(jié)果的準確性和可比性，仍是值得關(guān)注的問題。本文中在闡述現(xiàn)有常見體細胞檢測方法原理的基礎(chǔ)上，進一步探討了不同方法的性能指標和質(zhì)控要求，并提出通過計量校準來保證測量結(jié)果一致性的重要意義。

1 體細胞與DHI

1.1 DHI的概念

奶牛群體改良計劃（Dairy herd improvement，DHI）是指通過測量并記錄奶牛的產(chǎn)奶量、牛乳中主要成分（乳脂、乳蛋白等）、體細胞數(shù)目等多項指標，經(jīng)過分析得到反映奶牛場配種、繁殖、飼養(yǎng)、疾病以及生產(chǎn)性能等信息，從而為飼養(yǎng)和管理工作提供科學(xué)的依據(jù)。結(jié)合DHI 與遺傳學(xué)分析，德國選育出的荷斯坦牛具備遺傳背景優(yōu)良、品質(zhì)突出的特點，成為世界奶業(yè)的重要種屬資源［1］。國外奶牛生產(chǎn)先進國家，早在19 世紀末就開始進行DHI 測試工作，如美國、法國、荷蘭等乳業(yè)發(fā)達國家通過DHI 體系為奶農(nóng)提供指導(dǎo)服務(wù)，使牛群的遺傳水平和生產(chǎn)性能持續(xù)提高［2］。我國的DHI 起步較晚，1992 年引入DHI 技術(shù)，1999 年中國奶業(yè)協(xié)會組織成立了“全國奶牛生產(chǎn)性能測定（DHI）工作委員會”［3］，截止2013 年，我國奶牛參加DHI 測定的比例不足8%（美國、日本等發(fā)達國家的參測率已達50%以上）［4］。自2008 年起，我國大規(guī)模開展DHI 工作。2015 年農(nóng)業(yè)部根據(jù)《中國奶牛群體遺傳改良計劃（2008-2020）年》規(guī)定，制定了《奶牛生產(chǎn)性能測定工作辦法》。DHI 工作在我國逐步受到重視和信賴。

1.2 體細胞對乳制品的影響

體細胞數(shù)測定（Somatic cell count，SCC）是指每毫升牛奶中含有的體細胞數(shù)量，牛奶中的體細胞通常包括淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞以及少量的上皮細胞。體細胞數(shù)作為DHI 的重要檢測指標之一，與乳制品的質(zhì)量密切相關(guān)。優(yōu)質(zhì)生牛乳所具備的特征大致包括以下幾個方面：（1）包括蛋白質(zhì)和脂肪等的各項營養(yǎng)成分完整；（2）無異味；（3）檢測水平之下的藥物殘留量，沒有摻雜水或者其他添加物；（4）含有的細菌總量較低；（5）含有較低的體細胞數(shù)目［5］。體細胞的含量在衡量生牛乳質(zhì)量的多個指標中受到更多的關(guān)注，因為體細胞含量高往往會提高牛乳中酶活水平，而較高的酶活水平將導(dǎo)致牛乳中營養(yǎng)成分被破壞，從而對后續(xù)加工乳制品的質(zhì)量造成影響［6］。體細胞數(shù)量是診斷奶牛是否感染乳房炎或隱性乳房炎的主要指標，當奶牛乳房的炎癥加劇時，乳腺分泌大量的白細胞等免疫細胞，使牛奶中的體細胞數(shù)目顯著增加，而炎癥消失后，體細胞數(shù)目隨之減少。通過觀察牛奶中體細胞數(shù)目的變化，可以幫助盡早發(fā)現(xiàn)并隔離治療患有乳房炎的奶牛，不僅能夠減少由于奶牛乳房炎引起的經(jīng)濟損失，而且是控制牧場抗生素過度使用的有效手段［7］。

1.3 國內(nèi)外體細胞限量標準

國際上規(guī)定以每毫升牛奶中20 萬個體細胞作為判斷感染乳房炎的臨界值，每毫升牛奶中50 萬個以上體細胞表明奶?；紒喤R床（隱性）乳房炎［8-9］。歐盟與新西蘭對生乳中體細胞數(shù)的規(guī)定是低于40 萬個/mL，加拿大規(guī)定是低于50 萬個/mL，美國規(guī)定低于75 萬個/mL，并且各國正在考慮將體細胞限量標準進一步提高（達到更低的體細胞數(shù)）［10］。

2016 年中國農(nóng)墾乳業(yè)發(fā)展峰會上發(fā)布了《中國農(nóng)墾生鮮乳生產(chǎn)和質(zhì)量標準》。該企業(yè)標準首次將我國現(xiàn)行標準中沒有提到但反映奶牛乳房健康水平的體細胞數(shù)首次納入到了此次新發(fā)布的標準中，限量每毫升為40 萬個以下。2017 年中國奶業(yè)協(xié)會團體標準T /DAC 003-2017《學(xué)生飲用奶生牛乳》中規(guī)定體細胞數(shù)限量40 萬個/mL。2018 年修訂的GB 19301《食品安全國家標準生乳》（第一次討論稿）中首次增加了體細胞限量值分級標準。說明我國已開始重視體細胞對于乳制品的重要性，這對我國奶業(yè)發(fā)展有著重要的意義。

2 體細胞檢測方法及檢測儀器

2.1 國內(nèi)外標準規(guī)定的體細胞檢測方法及檢測 儀器

GB 19301《食品安全國家標準 生乳》（第一次討論稿）中體細胞檢測方法為NY/T 800 《生鮮牛乳中體細胞測定方法》。NY/T 800 是修改采用ISO 與IDF（國際乳品聯(lián)合會）聯(lián)合制定的國際標準ISO 13366-1：1997《牛奶 體細胞測定 第一部分 顯微鏡法（參考方法）》、ISO 13366-2：1997《牛奶 體細胞測定 第二部分 電子粒子計數(shù)法》和ISO 13366-3：1997《牛奶 體細胞測定 第三部分 熒光光電計數(shù)法》。目前，ISO 現(xiàn)行有效的是第二版的ISO 13366，包括第一部分（標準名稱未改變）及第二部分《牛奶 體細胞測定 第二部分 熒光光電計數(shù)儀操作指南》 （表1）。

顯微鏡法，即人工鏡檢法，是體細胞測定的參考方法，利用顯微鏡觀察涂布在載玻片上的牛奶樣品并進行人工的體細胞計數(shù)。該方法由人工操作，且對操作人員要求較高，不適用于大量檢測［11］。

表1 體細胞檢測方法國內(nèi)外標準

電子粒子計數(shù)法，也稱庫爾特計數(shù)儀計數(shù)法，該計數(shù)方法的原理是利用牛奶中體細胞在通過電極狹縫使由于增大電阻而使電壓上升的現(xiàn)象，最終通過高于臨界水平的電脈沖產(chǎn)生的數(shù)量來計算體細胞的數(shù)目［12］。新版的ISO 標準取消了此方法相關(guān)內(nèi)容，目前市場上此類儀器相對較少。

熒光光電計數(shù)法，利用熒光光電計數(shù)儀對體細胞進行計數(shù)，該類計數(shù)儀工作原理是首先利用染料（例如溴化乙錠）對體細胞的DNA 進行染色，在檢測過程中控制體細胞逐個通過流路系統(tǒng)，在相應(yīng)激發(fā)光的處理下，體細胞發(fā)出熒光信號，由捕捉到的熒光信號經(jīng)過光電倍增器放大并輸出光脈沖，分析計算得到計數(shù)結(jié)果［13］。因為熒光光電計數(shù)法具有檢測速度較快、重復(fù)測量誤差范圍較小等特點，且樣品處理過程較簡單，適合大批量牛奶樣品的集中 檢測。

目前奶站及企業(yè)中采用較多的即是利用熒光光電計數(shù)原理的體細胞檢測儀，具代表性的有丹麥Foss 公司及美國Bentley 公司的體細胞檢測儀［14］。例如，有研究者利用丹麥Foss 公司的體細胞檢測儀對奶牛場的牛乳體細胞數(shù)做了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)乳汁比重和牛乳中的乳蛋白、乳糖和非脂固形物含量均隨著體細胞數(shù)目的升高而下降，體細胞數(shù)與乳糖和非脂固形物含量呈顯著的負相關(guān)性［15］。同時，研究者也證明了牛乳中體細胞數(shù)目與抗氧化指標的相關(guān)性［16］。體細胞數(shù)目是牛乳營養(yǎng)控制的重要指標，熒光光電計數(shù)法被廣泛應(yīng)用于牛乳質(zhì)量的科學(xué)分析。

(1) 針對于平面形狀類似于正方形，且平面的長度和寬度尺寸太大，所處地質(zhì)條件很差的基坑工程，如果采用內(nèi)支撐結(jié)構(gòu)體系，需設(shè)置較多立柱，導(dǎo)致水平支撐構(gòu)件斷面增大、自重增大和施工工期加長；如采用不設(shè)內(nèi)支撐的懸臂支護樁或者樁錨體系，由于地質(zhì)條件較差，且工程周邊存在在建建筑，導(dǎo)致工程無法實施。采用明挖順筑與蓋挖逆筑的盆式開挖法施工時，以車站結(jié)構(gòu)板在水平向的整體剛度取代水平支撐體系，以及主體結(jié)構(gòu)進行逆作法施工，既減少了工程量，又節(jié)省了施工工期，同時還為土方開挖和材料運輸提供了空曠空間。

在具備上述優(yōu)勢的同時，熒光光電計數(shù)法所需的儀器和配套試劑較為昂貴，提高了牛乳中體細胞的檢測成本。由于該方法中體細胞的檢測是基于DNA 的染色，DNA 染色的效率直接影響體細胞的檢測結(jié)果，有研究者利用Foss Matic 檢測體細胞數(shù)目，觀察到在60℃對樣品進行孵育染色條件下測量得到的體細胞數(shù)明顯高于45℃孵育染色所得的結(jié)果［17］。如果對人工鏡檢法、庫爾特計數(shù)儀計數(shù)法和熒光光電計數(shù)法進行比較，有研究報道了熒光光電計數(shù)法對相同牛乳樣品中體細胞的測量結(jié)果高于前兩種方法［18］，分析其原因可能是熒光光電檢測系統(tǒng)中背景噪聲干擾引起的系統(tǒng)誤差。測量過程中的樣品處理條件和光電通路的檢測效率都將影響熒光光電計數(shù)法檢測的準確度。

2.2 其它體細胞檢測方法及儀器

根據(jù)檢測對象的不同，可以將牛奶中體細胞的檢測方法分為直接方法和間接方法。前面提到的標準檢測方法都是直接對體細胞進行觀察和測量，屬于直接測量方法。另外還有基于計算機視覺的直接計數(shù)方法，該方法在對牛奶中體細胞進行染色后，通過數(shù)碼顯微鏡采集細胞圖像（彩色圖像）；隨后將細胞突變灰度化，通過掃描并統(tǒng)計一定面積范圍內(nèi)的像素區(qū)域，來計算牛奶中的體細胞數(shù)目［19］，此類體檢細胞檢測儀器有丹麥ChemoMetec 公司的NucleoCounter SCC-400 等。

體細胞的間接檢測方法則是針對體細胞破裂后釋放出的DNA、組蛋白等物質(zhì)，以及體細胞含量上升導(dǎo)致的牛奶的粘稠度、pH 值、介電常數(shù)、流變特性等物理化學(xué)指標的變化，對體細胞的數(shù)目進行間接的測量。其中包括：加利福尼亞細胞測定法（CMT）、DNA 含量測定法、牛奶pH 值測定法、黏度測定法、電容法、近紅外線測定法、凝乳法以及超聲波測定法等［20-23］。近年來快速發(fā)展的微流控技術(shù)也被應(yīng)用于牛奶體細胞的檢測，Choi 等研制了可以同時檢測牛奶中體細胞、微生物以及抗生素殘留物的微流芯片傳感器［24-25］。

牛奶體細胞的間接檢測方法具有操作簡單、檢測成本低等優(yōu)勢，但其最大的問題是檢測的準確度較低，國家標準未推薦使用間接檢測方法。相比之下，直接檢測方法的準確度較高，但往往存在儀器成本高、樣品處理過程繁瑣等問題［26-27］，為了更好的在乳品產(chǎn)業(yè)中推廣應(yīng)用體細胞檢測技術(shù)，還需要研究并改進現(xiàn)有的檢測方法，以期實現(xiàn)牛奶中體細胞快速準確、成本控制在一定范圍內(nèi)的直接測量。

3 體細胞檢測儀校準

3.1 校準的含義

在JJF 1001-2011《通用計量術(shù)語及定義》［28］中，將校準定義為“在規(guī)定條件下的一組操作，其第一步是確定由測量標準提供的量值與相應(yīng)示值之間的關(guān)系，第二步則是用此信息確定由示值獲得測量結(jié)果的關(guān)系，這里測量標準提供的量值與相應(yīng)示值都具有測量不確定度”。通常，只把上述定義中的第一步認為是校準。此定義與ISO/IEC 導(dǎo)則99-2007（VIM）［29］中相應(yīng)條款一致。因此，校準是將計量器具的示值與測量標準相比較，確定計量器具的計量特性，從而確保量值準確。通過不間斷的校準鏈，可實現(xiàn)測量結(jié)果向高等級測量標準的計量溯源性。

3.2 體細胞檢測儀校準的意義

由于新國標已計劃將體細胞數(shù)限量納入生乳分級標準，體細胞數(shù)的準確測定將直接影響原奶奶源的正確分級。目前市場上體細胞檢測采用不同原理、不同生產(chǎn)廠商的體細胞檢測儀進行檢測，儀器的檢測性能主要依靠廠家提供的質(zhì)控樣品進行控制。但是往往質(zhì)控樣品存在儀器間不通用，缺乏量值溯源性等問題，造成不同原理的儀器之間檢測結(jié)果沒有可比性。

對測量儀器進行計量校準，就是將儀器對測量標準的實際測量值與測量標準標稱值進行比較，分析測量儀器的測量性能，通過嚴格的計量校準環(huán)節(jié)，可提高檢測結(jié)果準確性，實現(xiàn)檢測結(jié)果的可比、統(tǒng)一，真正體現(xiàn)體細胞數(shù)限量標準的意義，從而正確區(qū)分優(yōu)質(zhì)奶源與一般奶源，合理引導(dǎo)奶源的區(qū)別加工，規(guī)范市場秩序。作為DHI 測定體系的重要參數(shù)，體細胞數(shù)的準確測定有利于優(yōu)化奶牛群體結(jié)構(gòu)，促進乳業(yè)的科學(xué)性及規(guī)范化發(fā)展。

3.3 體細胞檢測儀校準的參數(shù)

基于日常開展的質(zhì)控程序，體細胞檢測儀需要進行校驗的指標可包括空白檢查，攜帶污染率（Carry-over，CO）檢查，試劑與檢測樣品體積比檢查，儀器短期穩(wěn)定性監(jiān)控與質(zhì)控圖繪制、重復(fù)性檢查、實驗室內(nèi)再現(xiàn)性檢查、實驗室間再現(xiàn)性檢查、實驗室間比對等內(nèi)容。在儀器校準前，需保證儀器的空白檢查、攜帶污染率（CO）、緩沖液與樣品體積比、重復(fù)性等指標滿足測量要求。NY/T 800 中，指出熒光光電計數(shù)法測定體細胞數(shù)需要進行校正，在體細胞含量為（40-50）萬個/mL 時，測定平均值與標樣指標值的相對誤差應(yīng)≤10%。

在第二版的ISO 13366-2 中，對儀器的校準及日常質(zhì)控做了詳細的規(guī)定。體細胞的校準主要通過標準物質(zhì)實現(xiàn)，標準物質(zhì)的生產(chǎn)需滿足ISO 導(dǎo)則34《標準物質(zhì)生產(chǎn)者能力的通用要求》的要求。已有國外的研究機構(gòu)報道了牛乳體細胞標準物質(zhì)的研制工作，利用牛乳中分離得到的體細胞，研究者研制了含有不同濃度體細胞的全脂和脫脂牛乳標準物質(zhì)，并進行了穩(wěn)定性檢測［30］。然而，國內(nèi)還沒有針對牛乳中體細胞的有證標準物質(zhì)。目前體細胞檢測儀器的校準主要依靠生產(chǎn)廠家提供的質(zhì)控品進行自校準。如丹麥Foss 公司提供模擬體細胞的微球（FMA 樣品）來監(jiān)控儀器，Bentley 公司提供適用于Bentley 儀器校準的體細胞質(zhì)控品。

ISO 13366-2 中建議針對不同類型的乳品，選擇覆蓋體細胞測量范圍的至少5 個不同濃度的標準物質(zhì)開展校準程序。目前市場上不同類型體細胞檢測儀在研發(fā)階段，對儀器性能指標進行評估，大多儀器選擇3 個不同濃度進行重復(fù)性檢測，選擇與人工鏡檢方法定值結(jié)果的相對誤差來評估儀器準確性（表2）。儀器宣稱指標均滿足ISO 標準的限量要求。

同時ISO 13366-2 中指出，在體細胞測量范圍內(nèi)，儀器的讀數(shù)與標準物質(zhì)量值之間應(yīng)滿足線性關(guān)系。用低體細胞數(shù)的牛奶稀釋高體細胞數(shù)的牛奶，得到測量范圍內(nèi)一系列（至少5 個）樣品進行測量，每個樣品至少測量4 次，將理論值平均值與測量值平均值做線性回歸，從回歸曲線計算殘差值ei=yi-（bxi+a）。ISO 13366-2 中選擇比例系數(shù)rc來表征線性關(guān)系。rc應(yīng)≤2%。rc由以下公式計算：

表2 不同類型體細胞檢測儀性能指標及ISO 標準限量值

其中：emax：最大殘差值；emin：最小殘差值；Mmax：測量樣品的上限值；Mmin：測量樣品的下限值。

從以上參數(shù)可以看出，體細胞數(shù)的準確測定需要對儀器進行全面檢查與質(zhì)量控制，當進行大量樣品或長期檢測之后，儀器的示值必須經(jīng)過校準，才能保證結(jié)果的準確性與可比性。

4 總結(jié)

隨著社會經(jīng)濟水平的提高和人民生活的改善，對于生牛乳的品質(zhì)要求也逐漸提高，體細胞數(shù)目是牛乳質(zhì)量控制的重要指標，體細胞數(shù)過高將導(dǎo)致牛乳中包括乳糖、乳蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)的含量降低，并提示乳牛出現(xiàn)乳房炎等健康問題。因此，低體細胞數(shù)是優(yōu)質(zhì)生乳的指標之一。新的國家標準將實施生乳分級，體細胞數(shù)作為重要分級指標，需要進行準確檢測。熒光光電計數(shù)法由于具有檢測快速、誤差范圍小等優(yōu)勢，被較多奶站和乳制品企業(yè)應(yīng)用于牛乳中體細胞的檢測。與此同時，還存在基于其他不同原理的體細胞檢測方法。由于檢測結(jié)果來源于不同的方法、不同的儀器以及不同的儀器生產(chǎn)廠家，因此需要進行校準來保證結(jié)果的準確性與可比性，進而指導(dǎo)牛乳的科學(xué)分級。

早在20 世紀，國外的研究者已經(jīng)開展了牛乳中體細胞標準物質(zhì)的研究工作，然而國內(nèi)至今還沒有針對牛乳體細胞的有證標準物質(zhì)，日常使用的體細胞檢測儀器主要依賴于生產(chǎn)廠商提供的質(zhì)控品進行自校準，使檢測結(jié)果的準確性和一致性難以保證，無法滿足牛乳質(zhì)量控制與科學(xué)管理的需求。目前，中國計量科學(xué)研究院與全國畜牧總站等正在開展體細胞標準物質(zhì)的研究工作，將為體細胞檢測儀的校準提供溯源依據(jù)。