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    PRMT1通過促進RRM2表達抑制鼻咽癌細胞凋亡

    2022-02-03 03:00:50周蘭柱張明潔馬士崟
    關(guān)鍵詞:活性氧鼻咽癌試劑盒

    周蘭柱,吳 俊,張明潔,趙 報,馬士崟

    蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,安徽 蚌埠 233000

    鼻咽癌(NPC)是具有高發(fā)病率類型的耳鼻喉惡性腫瘤,在中國南方、東南亞、北非和北極地區(qū)尤為普遍,具有獨特的地理分布。已經(jīng)確定了導(dǎo)致鼻咽癌的三個主要原因,包括愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒感染和遺傳易感性[1-3]。與其他頭頸部上皮癌不同,NPC位于頸部淋巴結(jié)附近,增加了身體其他部位轉(zhuǎn)移的風險。目前,放療和順鉑同步放療是標準鼻咽癌的治療方案,然而,10%~36%的鼻咽癌患者在標準治療后仍有局部復(fù)發(fā),這是鼻咽癌患者治療失敗和生存率低的主要原因[4,5]。因此,NPC靶向治療對抑制遠處轉(zhuǎn)移、早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測預(yù)后和監(jiān)測復(fù)發(fā)具有重要意義。

    蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)是甲基化精氨酸殘基的主要酶組,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工、DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)易位和腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過程中起關(guān)鍵作用[6,7]。PRMT1是PRMT家族成員中最重要的蛋白質(zhì)類型之一,研究證實PRMT1參與了多種腫瘤的惡性進展,表明PRMT1在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[8-11]。目前PRMT1在鼻咽癌中的作用尚無研究報道,因而,探究PRMT1在鼻咽癌中的生物學(xué)功能具有重要意義。核糖核苷酸還原酶亞單位M2(RRM2)是核糖核酸還原酶家族中的一員[12]。前期課題組使用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)RMT1表達干擾的NPC細胞進行下游基因變化分析,搜尋PRMT1相關(guān)或影響的細胞信號通路,選擇相關(guān)度較高的基因或通路,經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),RRM2可作為PRMT1的候選靶基因,查閱文獻發(fā)現(xiàn)RRM2在鼻咽癌預(yù)后中發(fā)揮重要價值,RRM2除參與DNA合成外,還在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)過程中能發(fā)揮重要作用[13-18],本實驗擬通過檢驗PRMT1與RRM2對鼻咽癌凋亡的影響及二者的關(guān)系,為鼻咽癌的治療或診斷提供一定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞 人HNEpC細胞(正常鼻黏膜上皮細胞)和人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-2、HNE1均購自上海細胞庫。

    1.1.2 藥品與試劑 Lipofectamin 2000(賽默飛);結(jié)晶紫、蛋白質(zhì)濃度檢測試劑、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物);兔抗蛋白質(zhì)PRMT1抗體、兔抗RRM2 抗 體、兔 抗Cleaved caspase-3 抗 體、兔 抗Cleaved caspase-8抗體、兔抗β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(上海艾博抗)。

    1.2 方法

    1.2.1 患者樣本收集 收集10對接受腫瘤手術(shù)切除患者的鼻咽癌標本及相應(yīng)的鄰近非腫瘤組織。手術(shù)切除的組織樣本在液氮中快速冷凍,并在-80 ℃保存。本研究不包括在手術(shù)治療前或手術(shù)治療后接受放療和/或免疫治療的患者。該研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的倫理準則,并得到醫(yī)院臨床研究倫理委員會的批準。參與本研究的每位患者均獲得書面知情同意。

    1.2.2 細胞培養(yǎng) HNEpC和5-8F、HNE1、CNE-2細胞培養(yǎng)在含有10%FBS并加入抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染分組 CNE-2細胞培養(yǎng)于六孔板,每孔細胞數(shù)融合度為六孔板的70%時對CNE-2 細胞中PRMT1和RRM2分別進行過表達和下調(diào),PRMT1和RRM2 siRNA及質(zhì)粒(上海吉瑪生物科技有限公司)使用Lipo2000將PRMT1和RRM2 siRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CNE-2細胞中。PRMT1過表達實驗設(shè)陰性對照組(oe NC)、PRMT1組(oe PRMT1)、下調(diào)實驗設(shè)陰性對照組(si-NC)及PRMT1小干涉RNA組(si-PRMT1),RRM2過表達實驗設(shè)陰性對照組(oe NC)、RRM2 組(oe RRM2)、下調(diào)實驗設(shè)陰性對照組(si-NC)及RRM2小干涉RNA組(si-RRM2),轉(zhuǎn)染步驟按照說明書進行。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)制造商的協(xié)議,使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。收集細胞及其上清液,用PBS洗滌2次。將AnnexinV-FITC加入懸浮細胞中,4 ℃黑暗孵育15 min。然后加入PI,在黑暗中孵育10 min。流式細胞儀對染色細胞進行分析。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.5 活性氧生成量的測定 熒光探針2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH)檢測細胞內(nèi)ROS水平,DCFH為一種細胞滲透性非熒光探針,在細胞內(nèi)ROS的存在下,在細胞內(nèi)脫酯化,轉(zhuǎn)化為高熒光分子2',7'-二氯熒光素(DCF)。細胞與5 μmol/L DCFH在37 ℃下孵育1 h,活細胞工作站對各組細胞拍照,分析各組結(jié)果。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.6 免疫組化法檢測鼻咽癌與癌旁組織PRMT1 和RRM2蛋白相對表達量 將組織固定、石蠟包埋、切片脫蠟,水化,在檸檬酸鹽中孵育緩沖液20 min獲得抗原修復(fù)。將組織用3%H2O2培養(yǎng)15 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。此后,組織切片被培養(yǎng)與兔抗PRMT1抗體(1∶200)在4 ℃下過夜,切片用PBS洗滌,次日加辣根過氧化物酶標記的IgG孵育15 min;兔抗RRM2抗體(1∶200)在4 ℃下過夜,切片用PBS洗滌,次日加辣根過氧化物酶標記的IgG孵育15 min,并用DAB顯影。1%蘇木精對細胞核進行二次染色,以胞質(zhì)染色呈棕褐色為陽性并使用光學(xué)顯微鏡拍照。免疫反應(yīng)(IRS)評分:由2位病理學(xué)專家評分;染色強度0~3分:依次為陰性、淺黃色、淺褐色、深褐色;陽性范圍0~4分:依次為0~25%、26%~50%、51%~75%、76%~100%。免疫反應(yīng)評分=染色強度評分×陽性范圍。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.7 Wetern blot法檢測蛋白相對表達量 使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液從組織和轉(zhuǎn)染的CNE-2細胞中提取蛋白質(zhì),使用BCA檢測試劑盒進行定量,將等量的各組蛋白在凝膠上進行電泳分離,分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;4 ℃下5%脫脂牛奶在搖床上封閉膜2 h,TBST洗滌后,分別加兔抗PRMT1(1∶1000)抗體、兔抗RRM2(1∶1000)抗體、兔抗Cleaved caspase-3(1∶1000)抗體、兔抗Cleaved caspase-8(1∶1000)抗體、兔抗β-actin(1∶1000)抗體,4 ℃冰箱過夜;TBST溶液漂洗3次并孵育2 h;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)在室溫下放置2 h,ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影,ImageJ軟件檢測條帶的灰度值進行蛋白定量。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 收集的所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 鼻咽癌和癌旁組織中PRMT1和RRM2的相對表達量

    評估PRMT1和RRM2在鼻咽癌組織中的表達情況,采用Western blot 法對鼻咽癌組織和癌旁組織中PRMT1和RRM2蛋白進行檢測,與癌旁組織相比,鼻咽癌組織中PRMT1 和RRM2 蛋白的表達均顯著增加(P<0.05,圖1A~C)。此外,免疫組化同樣證實與正常癌旁組織相比,鼻咽癌組織中,PRMT1和RRM2蛋白相對表達量均顯著增加(P<0.05,圖1D~F)。

    圖1 鼻咽癌和癌旁組織中PRMT1和RRM2的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.A: Western blotting for detecting the expression of PRMT1 and RRM2 proteins in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 proteins.D-F:Expression of PRMT1 and RRM2 detected by immunohistochemical staining(Original magnification: ×200).*P<0.05,**P<0.01 vs normal tissue(n=10).

    2.2 CNE-2細胞中PRMT1和RRM2表達量最高

    與癌旁組織相比,PRMT1和RRM2在鼻咽癌組織中高表達。為了評估PRMT1和RRM2在鼻咽癌細胞中的表達,用Western blot法對3種鼻咽癌細胞系5-8F、CNE-2、HNE1,以及HNEpC 作為對照組檢測PRMT1和RRM2蛋白表達量,與HNEpC細胞相比,PRMT1和RRM2 在3 種鼻咽癌細胞中表達均增加且CNE-2 細胞表達水平最高,因此選擇CNE-2細胞進行后續(xù)實驗(P<0.05,圖2A~C)。

    圖2 PRMT1和RRM2在鼻咽癌細胞株中的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma cell lines.A: Western blotting for detecting relative protein expressions of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma cells.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 protein bands.*P<0.05 vs HNEpC cells(n=3).

    2.3 PRMT1對CNE-2細胞凋亡的影響

    進一步研究PRMT1在NPC中的作用,分別過表達與下調(diào)PRMT1轉(zhuǎn)染CNE-2細胞,通過Western blot法檢測來評估過表達效率,在轉(zhuǎn)染了PRMT1 模擬物的CNE-2 細胞中,PRMT1 蛋白表達顯著增加,敲低PRMT1的CNE-2細胞中,PRMT1蛋白表達顯著減少,表明敲低成功(P<0.05,圖3D、E),檢測過表達與敲低PRMT1在調(diào)節(jié)細胞凋亡中的活性氧結(jié)果,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)PRMT1表達,si-PRMT1組CNE-2細胞中細胞活性氧增加(綠色熒光顯著),ROS可以調(diào)節(jié)細胞色素c的釋放,從而介導(dǎo)細胞凋亡,凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達PRMT1表達后,這些作用被抑制(圖3A~C)。此外,研究PRMT1影響CNE-2細胞凋亡的機制,Western blot分析檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3與Cleaved caspase-8的表達水平,過表達PRMT1 導(dǎo)致CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著降低,而敲低PRMT1 后CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加(P<0.05,圖3D、E)。

    圖3 PRMT1對CNE-2細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of PRMT1 knockdown or overexpression on apoptosis of CNE-2 cells.A,B:Intracellular reactive oxygen species(ROS)production in the cells(×200).C:Cell apoptosis analyzed with flow cytomrtry with AnnexinV-FITC/PI staining.D: Western blotting for detecting expressions of PRMT1,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.E:Gray values of the proteins(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.4 PRMT1促進RRM2的表達

    PRMT1敲低引起多種基因表達下調(diào),其中RRM2變化最為顯著。為了驗證PRMT1與RRM2的表達關(guān)系,當過表達CNE-2細胞中PRMT1表達后RRM2蛋白的表達顯著增加,下調(diào)PRMT1表達后RRM2蛋白的表達顯著降低(P<0.05,圖4A~C)。

    圖4 PRMT1與RRM2的表達關(guān)系Fig.4 Relationship between PRMT1 and RRM2 expression.A:Western blotting for detection of expressions of PRMT1 and RRM2 proteins in CNE-2 cells after PRMT1 knockdown.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 protein bands(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.5 RRM2對CNE-2細胞凋亡的影響

    為了探究RRM2在NPC中的作用,分別過表達與下調(diào)CNE-2細胞中RRM2的表達,成功過表達與敲低RRM2 后(P<0.05,圖5D、E),檢測過表達與敲低RRM2在調(diào)節(jié)CNE-2細胞凋亡中的活性氧結(jié)果,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)RRM2 表達,si-RRM2 組CNE-2細胞中細胞活性氧增加(綠色熒光顯著),凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達RRM2表達后,這些作用被抑制(圖5A~C)。過表達RRM2導(dǎo)致CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著降低,而敲低RRM2后CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加(P<0.05,圖5D、E)。

    圖5 RRM2對CNE-2細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of RRM2 after down-regulation of PRMT1 on apoptosis of CNE-2 cells.A,B: Intracellular ROS production in the cells(×200).C:Cell apoptosis detected by flow cytometry with AnnexinV-FITC/PI staining.D:Western blotting for detecting relative expressions of RRM2,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.E:Protein gray values(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.6 PRMT1通過促進RRM2表達影響CNE-2凋亡

    當下調(diào)PRMT1后同時過表達RRM2,CNE-2細胞活性氧與凋亡率較單獨下調(diào)PRMT1降低(P<0.05,圖6A~C),Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8蛋白表達顯著減少(P<0.05,圖6D、E),過表達RRM2能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)PRMT1對CNE-2的凋亡的促進作用。

    圖6 PRMT1通過促進RRM2表達影響CNE-2凋亡Fig.6 PRMT1 affects CNE-2 cell apoptosis by promoting RRM2 expression.A,B:Intracellular ROS levels in the cells(×200).C: Cell apoptosis detected by flow cytometry.D:Western blotting for detecting relative expressions of PRMT1,RRM2,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.D,E:Protein gray values(n=3,*P<0.05 vs oe-PRMT1+NC)

    3 討論

    先前研究已經(jīng)確定,PRMT1表達在非小細胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌中過表達,表明PRMT1表達升高是致癌過程[19]。PRMT1具有重要臨床意義,總體生存結(jié)果表明,PRMT1高的肝癌患者生存時間明顯減少。在其他消化道癌癥中,包括食道癌、胰腺癌和結(jié)腸腺癌中,PRMT1的表達也與患者的生存時間具有非常高的相關(guān)性[20,21]。所有這些數(shù)據(jù)表明,PRMT1可能在癌癥中發(fā)揮非常特殊的作用,并且可能成為未來癌癥治療的潛在新型藥物靶點。由此,猜測其在是否在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮促癌作用。研究首次發(fā)現(xiàn),PRMT1在鼻咽癌組織和鼻咽癌細胞CNE-2中高表達。先前研究表明,PRMT1與多種癌細胞的凋亡密切相關(guān)[22-24],PRMT1甲基化p14的C末端核/核仁定位序列(NLS/NoLS)中的幾個精氨酸殘基,隨后導(dǎo)致p53非依賴性胰腺癌細胞凋亡[25];此外,宮頸癌細胞中PRMT1表達的下調(diào)細胞凋亡增加顯著提高了它們對順鉑的敏感性,PRMT1表達有可能作為局部晚期宮頸癌患者的預(yù)測標志物[26]。這一發(fā)現(xiàn)有助于改善這些患者的預(yù)后。為了進一步研究PRMT1對CNE-2細胞凋亡的作用,分別過表達與下調(diào)PRMT1轉(zhuǎn)染CNE-2細胞,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)PRMT1表達,si-PRMT1組CNE-2細胞中細胞活性氧增加,表明誘導(dǎo)了細胞凋亡,凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達PRMT1表達后,這些作用被抑制。此外,研究PRMT1影響CNE-2細胞凋亡的機制,檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3與Cleaved caspase-8的表達水平,結(jié)果表明,PRMT1導(dǎo)致CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8 的表達顯著降低,而敲低PRMT1 后CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加,這些數(shù)據(jù)表明,PRMT1能夠抑制CNE-2細胞凋亡,凋亡機制可能與Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8相關(guān)。

    核糖核苷酸還原酶M2亞基(RRM2)調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶的酶活性,并且在癌癥研究中受到了極大的關(guān)注,因其在多種癌癥類型中表達失調(diào)[27],研究中發(fā)現(xiàn)RRM2在鼻咽癌細胞系和組織樣本中的表達高于非癌性鼻咽上皮細胞系和非癌性組織。最近的文獻表明,具有高RRM2的癌癥患者通常會在多種癌癥中出現(xiàn)不良預(yù)后和抑制癌細胞凋亡作用,例如視網(wǎng)膜母細胞瘤、宮頸癌、乳腺癌和食管癌,表明RRM2的表達與癌細胞凋亡有重要作用[28-31]。PRMT1作為鼻咽癌的促癌基因能夠抑制CNE-2 細胞凋亡,通過Western blot 證明了PRMT1 能夠促進RRM2 表達,因此,本研究檢測了RRM2對鼻咽癌細胞凋亡的影響。研究結(jié)果同樣證實了RRM2能夠促進CNE-2細胞凋亡,當過表達RRM2表達,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8蛋白相對表達減少,CNE-2細胞凋亡率減少;下調(diào)RRM2表達,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8蛋白相對表達增加,CNE-2細胞的凋亡率增加。

    為了研究PRMT1促進鼻咽癌凋亡是否與RRM2有關(guān),當下調(diào)PRMT1后同時過表達RRM2,CNE-2細胞活性氧與凋亡率較單獨下調(diào)PRMT1 降低,同時Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8蛋白表達顯著減少,表明過表達RRM2能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)PRMT1對CNE-2的凋亡的促進作用。

    綜上所述,PRMT1與RRM2在CNE-2細胞中均高表達,PRMT1通過促進RRM2的表達來抑制CNE-2細胞凋亡。本研究有助于探究PRMT1在鼻咽癌中的作用機制,并可能為改善鼻咽癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

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