• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PRMT1通過促進RRM2表達抑制鼻咽癌細胞凋亡

    2022-02-03 03:00:50周蘭柱張明潔馬士崟
    關(guān)鍵詞:活性氧鼻咽癌試劑盒

    周蘭柱,吳 俊,張明潔,趙 報,馬士崟

    蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,安徽 蚌埠 233000

    鼻咽癌(NPC)是具有高發(fā)病率類型的耳鼻喉惡性腫瘤,在中國南方、東南亞、北非和北極地區(qū)尤為普遍,具有獨特的地理分布。已經(jīng)確定了導(dǎo)致鼻咽癌的三個主要原因,包括愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒感染和遺傳易感性[1-3]。與其他頭頸部上皮癌不同,NPC位于頸部淋巴結(jié)附近,增加了身體其他部位轉(zhuǎn)移的風險。目前,放療和順鉑同步放療是標準鼻咽癌的治療方案,然而,10%~36%的鼻咽癌患者在標準治療后仍有局部復(fù)發(fā),這是鼻咽癌患者治療失敗和生存率低的主要原因[4,5]。因此,NPC靶向治療對抑制遠處轉(zhuǎn)移、早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測預(yù)后和監(jiān)測復(fù)發(fā)具有重要意義。

    蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)是甲基化精氨酸殘基的主要酶組,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工、DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)易位和腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過程中起關(guān)鍵作用[6,7]。PRMT1是PRMT家族成員中最重要的蛋白質(zhì)類型之一,研究證實PRMT1參與了多種腫瘤的惡性進展,表明PRMT1在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[8-11]。目前PRMT1在鼻咽癌中的作用尚無研究報道,因而,探究PRMT1在鼻咽癌中的生物學(xué)功能具有重要意義。核糖核苷酸還原酶亞單位M2(RRM2)是核糖核酸還原酶家族中的一員[12]。前期課題組使用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)RMT1表達干擾的NPC細胞進行下游基因變化分析,搜尋PRMT1相關(guān)或影響的細胞信號通路,選擇相關(guān)度較高的基因或通路,經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),RRM2可作為PRMT1的候選靶基因,查閱文獻發(fā)現(xiàn)RRM2在鼻咽癌預(yù)后中發(fā)揮重要價值,RRM2除參與DNA合成外,還在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)過程中能發(fā)揮重要作用[13-18],本實驗擬通過檢驗PRMT1與RRM2對鼻咽癌凋亡的影響及二者的關(guān)系,為鼻咽癌的治療或診斷提供一定實驗基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞 人HNEpC細胞(正常鼻黏膜上皮細胞)和人鼻咽癌細胞5-8F、CNE-2、HNE1均購自上海細胞庫。

    1.1.2 藥品與試劑 Lipofectamin 2000(賽默飛);結(jié)晶紫、蛋白質(zhì)濃度檢測試劑、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物);兔抗蛋白質(zhì)PRMT1抗體、兔抗RRM2 抗 體、兔 抗Cleaved caspase-3 抗 體、兔 抗Cleaved caspase-8抗體、兔抗β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(上海艾博抗)。

    1.2 方法

    1.2.1 患者樣本收集 收集10對接受腫瘤手術(shù)切除患者的鼻咽癌標本及相應(yīng)的鄰近非腫瘤組織。手術(shù)切除的組織樣本在液氮中快速冷凍,并在-80 ℃保存。本研究不包括在手術(shù)治療前或手術(shù)治療后接受放療和/或免疫治療的患者。該研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的倫理準則,并得到醫(yī)院臨床研究倫理委員會的批準。參與本研究的每位患者均獲得書面知情同意。

    1.2.2 細胞培養(yǎng) HNEpC和5-8F、HNE1、CNE-2細胞培養(yǎng)在含有10%FBS并加入抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染分組 CNE-2細胞培養(yǎng)于六孔板,每孔細胞數(shù)融合度為六孔板的70%時對CNE-2 細胞中PRMT1和RRM2分別進行過表達和下調(diào),PRMT1和RRM2 siRNA及質(zhì)粒(上海吉瑪生物科技有限公司)使用Lipo2000將PRMT1和RRM2 siRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CNE-2細胞中。PRMT1過表達實驗設(shè)陰性對照組(oe NC)、PRMT1組(oe PRMT1)、下調(diào)實驗設(shè)陰性對照組(si-NC)及PRMT1小干涉RNA組(si-PRMT1),RRM2過表達實驗設(shè)陰性對照組(oe NC)、RRM2 組(oe RRM2)、下調(diào)實驗設(shè)陰性對照組(si-NC)及RRM2小干涉RNA組(si-RRM2),轉(zhuǎn)染步驟按照說明書進行。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)制造商的協(xié)議,使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。收集細胞及其上清液,用PBS洗滌2次。將AnnexinV-FITC加入懸浮細胞中,4 ℃黑暗孵育15 min。然后加入PI,在黑暗中孵育10 min。流式細胞儀對染色細胞進行分析。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.5 活性氧生成量的測定 熒光探針2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH)檢測細胞內(nèi)ROS水平,DCFH為一種細胞滲透性非熒光探針,在細胞內(nèi)ROS的存在下,在細胞內(nèi)脫酯化,轉(zhuǎn)化為高熒光分子2',7'-二氯熒光素(DCF)。細胞與5 μmol/L DCFH在37 ℃下孵育1 h,活細胞工作站對各組細胞拍照,分析各組結(jié)果。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.6 免疫組化法檢測鼻咽癌與癌旁組織PRMT1 和RRM2蛋白相對表達量 將組織固定、石蠟包埋、切片脫蠟,水化,在檸檬酸鹽中孵育緩沖液20 min獲得抗原修復(fù)。將組織用3%H2O2培養(yǎng)15 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。此后,組織切片被培養(yǎng)與兔抗PRMT1抗體(1∶200)在4 ℃下過夜,切片用PBS洗滌,次日加辣根過氧化物酶標記的IgG孵育15 min;兔抗RRM2抗體(1∶200)在4 ℃下過夜,切片用PBS洗滌,次日加辣根過氧化物酶標記的IgG孵育15 min,并用DAB顯影。1%蘇木精對細胞核進行二次染色,以胞質(zhì)染色呈棕褐色為陽性并使用光學(xué)顯微鏡拍照。免疫反應(yīng)(IRS)評分:由2位病理學(xué)專家評分;染色強度0~3分:依次為陰性、淺黃色、淺褐色、深褐色;陽性范圍0~4分:依次為0~25%、26%~50%、51%~75%、76%~100%。免疫反應(yīng)評分=染色強度評分×陽性范圍。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.7 Wetern blot法檢測蛋白相對表達量 使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液從組織和轉(zhuǎn)染的CNE-2細胞中提取蛋白質(zhì),使用BCA檢測試劑盒進行定量,將等量的各組蛋白在凝膠上進行電泳分離,分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;4 ℃下5%脫脂牛奶在搖床上封閉膜2 h,TBST洗滌后,分別加兔抗PRMT1(1∶1000)抗體、兔抗RRM2(1∶1000)抗體、兔抗Cleaved caspase-3(1∶1000)抗體、兔抗Cleaved caspase-8(1∶1000)抗體、兔抗β-actin(1∶1000)抗體,4 ℃冰箱過夜;TBST溶液漂洗3次并孵育2 h;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)在室溫下放置2 h,ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影,ImageJ軟件檢測條帶的灰度值進行蛋白定量。實驗重復(fù)進行3次。

    1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 收集的所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 鼻咽癌和癌旁組織中PRMT1和RRM2的相對表達量

    評估PRMT1和RRM2在鼻咽癌組織中的表達情況,采用Western blot 法對鼻咽癌組織和癌旁組織中PRMT1和RRM2蛋白進行檢測,與癌旁組織相比,鼻咽癌組織中PRMT1 和RRM2 蛋白的表達均顯著增加(P<0.05,圖1A~C)。此外,免疫組化同樣證實與正常癌旁組織相比,鼻咽癌組織中,PRMT1和RRM2蛋白相對表達量均顯著增加(P<0.05,圖1D~F)。

    圖1 鼻咽癌和癌旁組織中PRMT1和RRM2的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.A: Western blotting for detecting the expression of PRMT1 and RRM2 proteins in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 proteins.D-F:Expression of PRMT1 and RRM2 detected by immunohistochemical staining(Original magnification: ×200).*P<0.05,**P<0.01 vs normal tissue(n=10).

    2.2 CNE-2細胞中PRMT1和RRM2表達量最高

    與癌旁組織相比,PRMT1和RRM2在鼻咽癌組織中高表達。為了評估PRMT1和RRM2在鼻咽癌細胞中的表達,用Western blot法對3種鼻咽癌細胞系5-8F、CNE-2、HNE1,以及HNEpC 作為對照組檢測PRMT1和RRM2蛋白表達量,與HNEpC細胞相比,PRMT1和RRM2 在3 種鼻咽癌細胞中表達均增加且CNE-2 細胞表達水平最高,因此選擇CNE-2細胞進行后續(xù)實驗(P<0.05,圖2A~C)。

    圖2 PRMT1和RRM2在鼻咽癌細胞株中的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma cell lines.A: Western blotting for detecting relative protein expressions of PRMT1 and RRM2 in nasopharyngeal carcinoma cells.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 protein bands.*P<0.05 vs HNEpC cells(n=3).

    2.3 PRMT1對CNE-2細胞凋亡的影響

    進一步研究PRMT1在NPC中的作用,分別過表達與下調(diào)PRMT1轉(zhuǎn)染CNE-2細胞,通過Western blot法檢測來評估過表達效率,在轉(zhuǎn)染了PRMT1 模擬物的CNE-2 細胞中,PRMT1 蛋白表達顯著增加,敲低PRMT1的CNE-2細胞中,PRMT1蛋白表達顯著減少,表明敲低成功(P<0.05,圖3D、E),檢測過表達與敲低PRMT1在調(diào)節(jié)細胞凋亡中的活性氧結(jié)果,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)PRMT1表達,si-PRMT1組CNE-2細胞中細胞活性氧增加(綠色熒光顯著),ROS可以調(diào)節(jié)細胞色素c的釋放,從而介導(dǎo)細胞凋亡,凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達PRMT1表達后,這些作用被抑制(圖3A~C)。此外,研究PRMT1影響CNE-2細胞凋亡的機制,Western blot分析檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3與Cleaved caspase-8的表達水平,過表達PRMT1 導(dǎo)致CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著降低,而敲低PRMT1 后CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加(P<0.05,圖3D、E)。

    圖3 PRMT1對CNE-2細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of PRMT1 knockdown or overexpression on apoptosis of CNE-2 cells.A,B:Intracellular reactive oxygen species(ROS)production in the cells(×200).C:Cell apoptosis analyzed with flow cytomrtry with AnnexinV-FITC/PI staining.D: Western blotting for detecting expressions of PRMT1,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.E:Gray values of the proteins(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.4 PRMT1促進RRM2的表達

    PRMT1敲低引起多種基因表達下調(diào),其中RRM2變化最為顯著。為了驗證PRMT1與RRM2的表達關(guān)系,當過表達CNE-2細胞中PRMT1表達后RRM2蛋白的表達顯著增加,下調(diào)PRMT1表達后RRM2蛋白的表達顯著降低(P<0.05,圖4A~C)。

    圖4 PRMT1與RRM2的表達關(guān)系Fig.4 Relationship between PRMT1 and RRM2 expression.A:Western blotting for detection of expressions of PRMT1 and RRM2 proteins in CNE-2 cells after PRMT1 knockdown.B,C:Gray value of PRMT1 and RRM2 protein bands(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.5 RRM2對CNE-2細胞凋亡的影響

    為了探究RRM2在NPC中的作用,分別過表達與下調(diào)CNE-2細胞中RRM2的表達,成功過表達與敲低RRM2 后(P<0.05,圖5D、E),檢測過表達與敲低RRM2在調(diào)節(jié)CNE-2細胞凋亡中的活性氧結(jié)果,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)RRM2 表達,si-RRM2 組CNE-2細胞中細胞活性氧增加(綠色熒光顯著),凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達RRM2表達后,這些作用被抑制(圖5A~C)。過表達RRM2導(dǎo)致CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著降低,而敲低RRM2后CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加(P<0.05,圖5D、E)。

    圖5 RRM2對CNE-2細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of RRM2 after down-regulation of PRMT1 on apoptosis of CNE-2 cells.A,B: Intracellular ROS production in the cells(×200).C:Cell apoptosis detected by flow cytometry with AnnexinV-FITC/PI staining.D:Western blotting for detecting relative expressions of RRM2,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.E:Protein gray values(n=3,*P<0.05 vs oe NC/si-NC).

    2.6 PRMT1通過促進RRM2表達影響CNE-2凋亡

    當下調(diào)PRMT1后同時過表達RRM2,CNE-2細胞活性氧與凋亡率較單獨下調(diào)PRMT1降低(P<0.05,圖6A~C),Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8蛋白表達顯著減少(P<0.05,圖6D、E),過表達RRM2能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)PRMT1對CNE-2的凋亡的促進作用。

    圖6 PRMT1通過促進RRM2表達影響CNE-2凋亡Fig.6 PRMT1 affects CNE-2 cell apoptosis by promoting RRM2 expression.A,B:Intracellular ROS levels in the cells(×200).C: Cell apoptosis detected by flow cytometry.D:Western blotting for detecting relative expressions of PRMT1,RRM2,cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8.D,E:Protein gray values(n=3,*P<0.05 vs oe-PRMT1+NC)

    3 討論

    先前研究已經(jīng)確定,PRMT1表達在非小細胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌中過表達,表明PRMT1表達升高是致癌過程[19]。PRMT1具有重要臨床意義,總體生存結(jié)果表明,PRMT1高的肝癌患者生存時間明顯減少。在其他消化道癌癥中,包括食道癌、胰腺癌和結(jié)腸腺癌中,PRMT1的表達也與患者的生存時間具有非常高的相關(guān)性[20,21]。所有這些數(shù)據(jù)表明,PRMT1可能在癌癥中發(fā)揮非常特殊的作用,并且可能成為未來癌癥治療的潛在新型藥物靶點。由此,猜測其在是否在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮促癌作用。研究首次發(fā)現(xiàn),PRMT1在鼻咽癌組織和鼻咽癌細胞CNE-2中高表達。先前研究表明,PRMT1與多種癌細胞的凋亡密切相關(guān)[22-24],PRMT1甲基化p14的C末端核/核仁定位序列(NLS/NoLS)中的幾個精氨酸殘基,隨后導(dǎo)致p53非依賴性胰腺癌細胞凋亡[25];此外,宮頸癌細胞中PRMT1表達的下調(diào)細胞凋亡增加顯著提高了它們對順鉑的敏感性,PRMT1表達有可能作為局部晚期宮頸癌患者的預(yù)測標志物[26]。這一發(fā)現(xiàn)有助于改善這些患者的預(yù)后。為了進一步研究PRMT1對CNE-2細胞凋亡的作用,分別過表達與下調(diào)PRMT1轉(zhuǎn)染CNE-2細胞,結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)PRMT1表達,si-PRMT1組CNE-2細胞中細胞活性氧增加,表明誘導(dǎo)了細胞凋亡,凋亡試劑盒進一步定量證明了細胞凋亡增加,而在過表達PRMT1表達后,這些作用被抑制。此外,研究PRMT1影響CNE-2細胞凋亡的機制,檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3與Cleaved caspase-8的表達水平,結(jié)果表明,PRMT1導(dǎo)致CNE-2細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8 的表達顯著降低,而敲低PRMT1 后CNE-2 細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8的表達顯著增加,這些數(shù)據(jù)表明,PRMT1能夠抑制CNE-2細胞凋亡,凋亡機制可能與Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8相關(guān)。

    核糖核苷酸還原酶M2亞基(RRM2)調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶的酶活性,并且在癌癥研究中受到了極大的關(guān)注,因其在多種癌癥類型中表達失調(diào)[27],研究中發(fā)現(xiàn)RRM2在鼻咽癌細胞系和組織樣本中的表達高于非癌性鼻咽上皮細胞系和非癌性組織。最近的文獻表明,具有高RRM2的癌癥患者通常會在多種癌癥中出現(xiàn)不良預(yù)后和抑制癌細胞凋亡作用,例如視網(wǎng)膜母細胞瘤、宮頸癌、乳腺癌和食管癌,表明RRM2的表達與癌細胞凋亡有重要作用[28-31]。PRMT1作為鼻咽癌的促癌基因能夠抑制CNE-2 細胞凋亡,通過Western blot 證明了PRMT1 能夠促進RRM2 表達,因此,本研究檢測了RRM2對鼻咽癌細胞凋亡的影響。研究結(jié)果同樣證實了RRM2能夠促進CNE-2細胞凋亡,當過表達RRM2表達,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8蛋白相對表達減少,CNE-2細胞凋亡率減少;下調(diào)RRM2表達,Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8蛋白相對表達增加,CNE-2細胞的凋亡率增加。

    為了研究PRMT1促進鼻咽癌凋亡是否與RRM2有關(guān),當下調(diào)PRMT1后同時過表達RRM2,CNE-2細胞活性氧與凋亡率較單獨下調(diào)PRMT1 降低,同時Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8蛋白表達顯著減少,表明過表達RRM2能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)PRMT1對CNE-2的凋亡的促進作用。

    綜上所述,PRMT1與RRM2在CNE-2細胞中均高表達,PRMT1通過促進RRM2的表達來抑制CNE-2細胞凋亡。本研究有助于探究PRMT1在鼻咽癌中的作用機制,并可能為改善鼻咽癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

    猜你喜歡
    活性氧鼻咽癌試劑盒
    中醫(yī)藥治療鼻咽癌研究進展
    鼻咽癌組織Raf-1的表達與鼻咽癌放療敏感性的關(guān)系探討
    癌癥進展(2016年11期)2016-03-20 13:16:00
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
    鼻咽癌的中西醫(yī)結(jié)合診治
    TLR3活化對正常人表皮黑素細胞內(nèi)活性氧簇表達的影響
    硅酸鈉處理對杏果實活性氧和苯丙烷代謝的影響
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標準的研究
    O2聯(lián)合CO2氣調(diào)對西蘭花活性氧代謝及保鮮效果的影響
    活性氧調(diào)節(jié)單核細胞增生李斯特菌菌膜形成
    在线播放无遮挡| 免费黄网站久久成人精品 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 中国美女看黄片| 欧美bdsm另类| 国产成人欧美在线观看| 国产一区二区激情短视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久人妻av系列| 99在线人妻在线中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 又爽又黄无遮挡网站| av在线天堂中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 一个人看的www免费观看视频| 色视频www国产| www.www免费av| 国产黄a三级三级三级人| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品久久久久久精品电影| 永久网站在线| 热99re8久久精品国产| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美日韩黄片免| 欧美潮喷喷水| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99热6这里只有精品| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久成人免费电影| 国产av在哪里看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 人人妻人人看人人澡| 中文字幕免费在线视频6| 午夜精品久久久久久毛片777| 一区二区三区四区激情视频 | 午夜影院日韩av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| av在线老鸭窝| 高清毛片免费观看视频网站| АⅤ资源中文在线天堂| 精品人妻1区二区| 成人国产综合亚洲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一本一本综合久久| 国产一区二区在线av高清观看| 又紧又爽又黄一区二区| 级片在线观看| 一本一本综合久久| 精品久久久久久久久av| 国产三级中文精品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美激情在线99| 欧美bdsm另类| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 人人妻人人看人人澡| 日本黄色片子视频| 在线观看午夜福利视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美乱色亚洲激情| 国产高清三级在线| 高清在线国产一区| 美女高潮的动态| 亚洲精品在线观看二区| 中文字幕av在线有码专区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人av教育| 亚洲黑人精品在线| 免费看美女性在线毛片视频| 天天躁日日操中文字幕| 夜夜爽天天搞| 男女之事视频高清在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 此物有八面人人有两片| .国产精品久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 老女人水多毛片| 午夜福利视频1000在线观看| or卡值多少钱| 亚洲片人在线观看| 不卡一级毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 色综合婷婷激情| 桃色一区二区三区在线观看| 一个人免费在线观看电影| 久久久久久久午夜电影| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品sss在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 网址你懂的国产日韩在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产在视频线在精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美激情在线99| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久国产乱子免费精品| 一区二区三区高清视频在线| 99视频精品全部免费 在线| 色5月婷婷丁香| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产真实乱freesex| 欧美成人性av电影在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 91久久精品电影网| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av不卡在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品一及| 深夜a级毛片| av天堂中文字幕网| 午夜视频国产福利| 色av中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 天堂√8在线中文| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久久色成人| 亚洲av成人av| 中文字幕av成人在线电影| 中文字幕高清在线视频| 99热这里只有精品一区| 国内精品久久久久久久电影| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美成人性av电影在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久久成人免费电影| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品久久久久久久电影| 中文字幕av在线有码专区| av在线老鸭窝| 国产v大片淫在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| 国产精华一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 精品午夜福利在线看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 小说图片视频综合网站| 亚洲,欧美,日韩| 日本一本二区三区精品| 嫁个100分男人电影在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产欧美日韩精品亚洲av| www.色视频.com| 成年女人看的毛片在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 91九色精品人成在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 老女人水多毛片| 中文字幕高清在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品人妻熟女av久视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看午夜福利视频| 俺也久久电影网| 在线观看午夜福利视频| 69人妻影院| 欧美一区二区亚洲| 日本a在线网址| 成人午夜高清在线视频| 丝袜美腿在线中文| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美一区二区亚洲| 我要搜黄色片| 我要搜黄色片| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 男人舔女人下体高潮全视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久人人精品亚洲av| 午夜影院日韩av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美午夜高清在线| 99热只有精品国产| www.色视频.com| 97超视频在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 床上黄色一级片| 在线天堂最新版资源| 露出奶头的视频| 日韩亚洲欧美综合| 天堂影院成人在线观看| 88av欧美| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲成人久久性| 91字幕亚洲| 午夜福利18| 精品久久久久久久久亚洲 | 伦理电影大哥的女人| 婷婷亚洲欧美| 欧美区成人在线视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久久久电影| .国产精品久久| 国产一区二区三区视频了| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 动漫黄色视频在线观看| 1000部很黄的大片| 久久久久久九九精品二区国产| 国产野战对白在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 丰满的人妻完整版| 美女免费视频网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜福利欧美成人| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲18禁久久av| 变态另类丝袜制服| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国产激情偷乱视频一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 伦理电影大哥的女人| 久久国产精品影院| 两个人的视频大全免费| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 婷婷色综合大香蕉| 一进一出好大好爽视频| 少妇的逼好多水| or卡值多少钱| 男女之事视频高清在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产美女午夜福利| 国产69精品久久久久777片| 又爽又黄a免费视频| 麻豆一二三区av精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美最新免费一区二区三区 | av天堂在线播放| 美女大奶头视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人影院久久av| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久精品综合一区二区三区| 99久久精品热视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产三级中文精品| 一区福利在线观看| www.999成人在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产一区二区在线av高清观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本a在线网址| 国产成人影院久久av| 久99久视频精品免费| 国产69精品久久久久777片| 亚洲人成网站高清观看| 看黄色毛片网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产伦一二天堂av在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久香蕉精品热| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲综合色惰| 深爱激情五月婷婷| 中国美女看黄片| 久久99热6这里只有精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产午夜精品论理片| 久久香蕉精品热| 一a级毛片在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 岛国在线免费视频观看| 成人av在线播放网站| 99热这里只有是精品50| 黄色一级大片看看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲激情在线av| 深爱激情五月婷婷| 99riav亚洲国产免费| 久久久久性生活片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费av毛片视频| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品456在线播放app | 高潮久久久久久久久久久不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 日本五十路高清| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费av观看视频| 国产高潮美女av| 免费电影在线观看免费观看| 超碰av人人做人人爽久久| 无人区码免费观看不卡| 国产成人a区在线观看| 黄色一级大片看看| 精品人妻视频免费看| 国产av不卡久久| 桃红色精品国产亚洲av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 搞女人的毛片| 午夜福利18| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲成av人片免费观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲最大成人中文| av天堂在线播放| 色哟哟·www| 欧美成狂野欧美在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美日韩无卡精品| 我要看日韩黄色一级片| 午夜激情欧美在线| 国内精品久久久久精免费| 亚洲电影在线观看av| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久亚洲真实| 亚洲精品456在线播放app | 国产综合懂色| 在线播放无遮挡| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99在线人妻在线中文字幕| 嫩草影院入口| 女人被狂操c到高潮| 在线播放无遮挡| 成人国产一区最新在线观看| 久久久久久久久大av| 69av精品久久久久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲午夜理论影院| 91字幕亚洲| 一级毛片久久久久久久久女| x7x7x7水蜜桃| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 身体一侧抽搐| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美zozozo另类| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产免费av片在线观看野外av| 90打野战视频偷拍视频| 一进一出抽搐动态| 免费在线观看日本一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品av视频在线免费观看| av视频在线观看入口| 婷婷丁香在线五月| 欧美区成人在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久性生活片| 日韩大尺度精品在线看网址| 999久久久精品免费观看国产| АⅤ资源中文在线天堂| 99精品久久久久人妻精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久午夜福利片| 亚洲精品456在线播放app | av在线老鸭窝| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费搜索国产男女视频| 国产在视频线在精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一进一出抽搐gif免费好疼| 有码 亚洲区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品野战在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 哪里可以看免费的av片| 亚洲国产色片| 亚洲中文日韩欧美视频| 色在线成人网| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲经典国产精华液单 | 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| eeuss影院久久| 中国美女看黄片| 精品一区二区三区av网在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| a级毛片a级免费在线| 欧美黄色淫秽网站| 精品福利观看| 五月玫瑰六月丁香| 日韩有码中文字幕| 国产伦在线观看视频一区| 国产男靠女视频免费网站| 69av精品久久久久久| 男女那种视频在线观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美性感艳星| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲七黄色美女视频| 久久精品国产亚洲av天美| 日本黄大片高清| 久久久久久久午夜电影| 欧美黄色淫秽网站| 欧美最新免费一区二区三区 | 十八禁人妻一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲成人免费电影在线观看| 草草在线视频免费看| 99riav亚洲国产免费| 99精品在免费线老司机午夜| 成人国产一区最新在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情福利司机影院| 欧美乱色亚洲激情| 热99在线观看视频| 成人无遮挡网站| 久久久精品大字幕| 成人av一区二区三区在线看| 波多野结衣高清作品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美色视频一区免费| 国产精品电影一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av电影在线进入| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 91在线观看av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 嫩草影院精品99| 成年免费大片在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲片人在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲三级黄色毛片| 91字幕亚洲| 九九热线精品视视频播放| 免费看日本二区| 午夜两性在线视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品日产1卡2卡| 久久精品91蜜桃| 此物有八面人人有两片| 免费无遮挡裸体视频| 精品日产1卡2卡| av视频在线观看入口| 91久久精品电影网| 精品久久久久久成人av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久久久av| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| a级一级毛片免费在线观看| 久久99热这里只有精品18| 国产午夜精品论理片| 亚洲经典国产精华液单 | 午夜精品一区二区三区免费看| 精品人妻1区二区| 午夜免费激情av| 黄色配什么色好看| 一进一出好大好爽视频| 青草久久国产| 在线观看舔阴道视频| 一本综合久久免费| 国产精品久久久久久精品电影| 久久午夜福利片| 在线观看舔阴道视频| 日本与韩国留学比较| 99久久无色码亚洲精品果冻| 十八禁国产超污无遮挡网站| 不卡一级毛片| 婷婷色综合大香蕉| 一本久久中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 美女大奶头视频| 国产三级黄色录像| bbb黄色大片| 在线观看午夜福利视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 又爽又黄a免费视频| 久久热精品热| 舔av片在线| 免费看日本二区| .国产精品久久| 淫秽高清视频在线观看| 99热6这里只有精品| 中文字幕av在线有码专区| 婷婷色综合大香蕉| 偷拍熟女少妇极品色| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产黄片美女视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩av在线大香蕉| 99久久成人亚洲精品观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲av一区综合| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美三级亚洲精品| 五月玫瑰六月丁香| 简卡轻食公司| 亚洲经典国产精华液单 | 日韩欧美免费精品| 麻豆av噜噜一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| 欧美在线黄色| 国产人妻一区二区三区在| 欧美高清成人免费视频www| 美女免费视频网站| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲欧美日韩东京热| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美最新免费一区二区三区 | 日本a在线网址| 日韩欧美在线二视频| 国产野战对白在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久草成人影院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本成人三级电影网站| 五月玫瑰六月丁香| 美女cb高潮喷水在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产91精品成人一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲内射少妇av| 两人在一起打扑克的视频| 欧美乱色亚洲激情| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品99久久久久久久久| www.色视频.com| 久9热在线精品视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本一本二区三区精品| 日韩欧美 国产精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久大精品| 日日夜夜操网爽| 2021天堂中文幕一二区在线观| 性色avwww在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲18禁久久av| a在线观看视频网站| 亚洲av五月六月丁香网| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产视频内射| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久精品国产欧美久久久| 永久网站在线| а√天堂www在线а√下载| 国产午夜精品论理片| 久久亚洲精品不卡| 青草久久国产| netflix在线观看网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| av女优亚洲男人天堂| 看黄色毛片网站| 成人特级av手机在线观看| 中出人妻视频一区二区| 亚洲 国产 在线| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲avbb在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 精品免费久久久久久久清纯| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产成年人精品一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 欧美区成人在线视频| а√天堂www在线а√下载| 国内精品久久久久精免费| 亚洲乱码一区二区免费版| 在线免费观看不下载黄p国产 | 嫩草影院精品99| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久中文看片网| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美又色又爽又黄视频| 性色avwww在线观看|