杏褪綠卷葉植原體新疆分離物16SrDNA基因克隆與序列分析

艾克熱木·買買提 韓劍 羅明

摘要 利用植原體16S rDNA基因通用引物對(duì)新疆輪臺(tái)縣疑似杏褪綠卷葉病植株總DNA進(jìn)行巢氏PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出大小約1.2 kb的特異性條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和測(cè)序，確定特異片段大小為1 248 bp。序列同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，新疆杏褪綠卷葉植原體不同分離株16S rDNA基因序列同源性極高，達(dá)到99.8%～100%。與16SrⅤ組成員的同源性達(dá)到98.2%以上，其中與16SrⅤ-B亞組的棗瘋病植原體山東寶山分離株，甜櫻桃綠化植原體山東分離株同源性最高，達(dá)到99.4%～99.6%。進(jìn)一步虛擬RFLP分析，結(jié)果表明該植原體屬于榆樹黃化組（16SrⅤ）的一個(gè)新的亞組，與其相似性最高的是16SrⅤ-B亞組，相似系數(shù)為0.94。本研究首次報(bào)道了新疆杏褪綠卷葉植原體16S rDNA的序列，確定了其分類地位，為杏褪綠卷葉病的早期診斷和檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 杏; 杏褪綠卷葉病; 植原體; 16S rDNA; 序列分析

中圖分類號(hào)： S 436.6 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019046

Abstract By using Nested-PCR， the 16S rDNA of phytoplasma of apricot chlorotic leaf roll （ACLR） in diseased sample from Luntai region in Xinjiang was amplified by the universal primer pairs， then a phytoplasma-specific 1.2 kb fragment were amplified by nested-PCR. The 16S rDNA gene was cloned by polymerase chain reaction from samples of ACLR， they were then sequenced. The result of sequencing showed that the ACLR strains from Xinjiang consists of 1 248 bp in 16S rDNA gene. The similarity and phylogenetic analysis showed that the six ACLR isolates sequenced from Luntai region are closely related to each other， displaying 99.8%-100% nucleotide sequence similarity， and the six isolates shared approximately 98.2% identity with 16SrⅤ group， the results of blast showed that the genetic distance of six isolates was closely to the 16SrⅤ-B subgroup，which shared the highest similarity （99.4%-99.6%） with the strains of prunus avium virescence phytoplasma （MF848965） from Shandong and jujube witches-broom phytoplasma （EU999737） from Shandong. Furthermore， virtual RFLP analysis showed that the phytoplasma belonged to a new subgroup within the elm yellows group（16SrⅤ）， the most similar was the reference pattern of the 16Sr group Ⅴ， subgroup B （GenBank accession： AB05287）， with a similarity coefficient of 0.94. This study reports 16S rDNA sequences of ACLR phytoplasmas and classified phytoplasma of ACLR in Xinjiang for the first time， it provides the base for early diagnosis and detection.

Key words apricot; apricot chlorotic leafroll; phytoplasma; 16S rDNA; sequence analysis

杏Armeniaca vulgaris為薔薇科杏屬植物，是中國(guó)栽培歷史最悠久的果樹之一。新疆作為杏的原生起源中心，擁有豐富的杏種質(zhì)資源，其栽培面積和產(chǎn)量均居中國(guó)各?。▍^(qū)）之首。杏褪綠卷葉?。╝pricot chlorotic leaf roll disease）是危害杏樹的一種高致死性植原體病害。該病害于1973年首次在法國(guó)杏樹上發(fā)現(xiàn)，之后陸續(xù)在歐洲其他核果類樹種如扁桃、歐洲李、櫻桃、桃和油桃等多種果樹上發(fā)現(xiàn)，成為影響歐洲核果類果樹商業(yè)化栽培的主要病害。中國(guó)，歐洲和北美均將其列入進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病害名錄[1-2]。1993年，趙京民對(duì)北京、河北、山西等地出現(xiàn)嚴(yán)重早期落葉的杏樹植株的組織切片進(jìn)行了電鏡觀察，初步判斷可能是由類菌原體所致[3]。2007年李文慧等[4]首次在新疆輪臺(tái)縣的杏園中發(fā)現(xiàn)了杏褪綠卷葉病疑似病株，癥狀主要表現(xiàn)為葉片褪綠斑駁、變紅，樹冠中、下部甚至全株葉片沿主脈向上翻卷成筒狀，早衰落果，果小味差，輕者產(chǎn)量降低，重者4～5 a內(nèi)整株死亡，通過電鏡觀察確定引起新疆杏褪綠卷葉病的病原為植原體。

本研究于2016-2018年連續(xù)3年對(duì)新疆輪臺(tái)縣、托克遜縣杏褪綠卷葉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)該病害從零星、局部發(fā)生到范圍逐漸擴(kuò)大、發(fā)病程度逐年加重，部分杏園的發(fā)病率已超過30%，嚴(yán)重的超過60%，患病果園減產(chǎn)可達(dá)20%～50%，嚴(yán)重影響杏果品質(zhì)。該病害對(duì)近年來(lái)蓬勃發(fā)展的新疆經(jīng)濟(jì)支柱林果產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大隱患。本研究對(duì)新疆杏生產(chǎn)區(qū)杏褪綠卷葉病疑似病株進(jìn)行植原體16S rDNA PCR 擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定，獲取病原菌的分子信息，確定其分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年8月至2018年8月在新疆輪臺(tái)縣國(guó)家果樹資源圃采集表現(xiàn)為葉片上卷、葉肉有不規(guī)則褪綠斑的疑似杏褪綠卷葉病樣品。將采集的葉片、枝條、葉柄等組織，保存于保鮮袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于4℃和-40℃冰箱中。同時(shí)采集健康植株枝葉作為對(duì)照。

試劑及儀器：新型植物基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司?？寺≥d體pMD 19T以及其他酶類等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）。

1.2 樣品總DNA提取

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒和改良CTAB法[5]提取杏樹葉中脈及韌皮部總DNA。

1.3 植原體16S rDNA的巢式PCR擴(kuò)增

1.3.1 引物

參照Lee等[6]根據(jù)植原體16S rDNA序列設(shè)計(jì)的通用引物對(duì)。R16mF2/R16mR2為外側(cè)引物對(duì)，R16F2n/R16R2為內(nèi)側(cè)引物對(duì)。R16mF2： 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′，R16mR2： 5′-CTTAACCCCAAT CATCGA-3′;R16F2n： 5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′;R16R2： 5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成。

1.3.2 巢氏PCR擴(kuò)增

以提取的供試樣品總DNA為模板，用外側(cè)引物R16mF2/R16mR2進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，10×PCR buffer （含2.5 mmol/L MgCl2）2.5 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.3 μL，滅菌超純水 17.2 μL。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性4 min;94℃變性 45 s，50℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

如外側(cè)引物擴(kuò)增出目的條帶，則將1 μL PCR產(chǎn)物稀釋30倍后取1 μL作為模板;如未擴(kuò)增出目的條帶，則直接取1 μL PCR產(chǎn)物作為模板，以內(nèi)側(cè)引物R16F2n/R16R2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件與第一輪PCR相同。

1.3.3 PCR產(chǎn)物電泳分析

取PCR產(chǎn)物在添加Goldview染料的瓊脂糖（濃度為10 g/L）中進(jìn)行電泳（1×TAE 緩沖系統(tǒng)），使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍攝圖片。

1.4 PCR產(chǎn)物的回收與克隆

將巢式PCR產(chǎn)物中的特異性條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，純化?；厥盏腜CR產(chǎn)物與載體pMD19T在16℃下連接2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有X-gal （20 g/L）、IPTG （50 g/L）、Amp （100 mg/L）的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)14～16 h，形成單菌落。將篩選出的陽(yáng)性單菌落接種于含Amp （100 mg/L）LB液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用R16F2n/R16R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切鑒定。

1.5 序列測(cè)定與分析

將篩選獲得的含有目的片段的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST檢索，通過DNAMAN 5.2.2將測(cè)得序列與植原體16Sr各組中的代表性植原體的16S rDNA序列進(jìn)行核酸同源性比較，利用MEGA 5.0軟件[7]的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。并利用植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier[8]和pDRAW32軟件對(duì)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物及植原體16SrⅤ組各亞組參考株系16SrⅤ-A （AY197655）[9]、16SrⅤ-B （AB052876）[10]、16SrⅤ-C （AY197642）[11]、16SrⅤ-D （AY197644）[11]、16SrⅤ-E （AY197650）[12]、16SrⅤ-F （AB689678）[13]、16SrⅤ-G （AB052879）[10]、16SrⅤ-H （KJ452547）[14]、16SrⅤ-I （KR233473）[15]的16S rDNA序列（R16F2n/R16R2擴(kuò)增片段）進(jìn)行Alu Ⅰ等17種限制性內(nèi)切酶的虛擬酶切分析，根據(jù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析結(jié)果鑒定出褪綠卷葉植原體新疆分離物所在組為16Sr組/亞組。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆杏褪綠卷葉病癥狀表現(xiàn)

與健康植株相比，感病植株樹冠中、下部甚至全株葉片從葉柄到葉尖邊緣沿主脈向上翻卷成筒狀，葉片表面呈不規(guī)則褪綠斑駁，感病株果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，果實(shí)成熟期推遲，品質(zhì)變劣，產(chǎn)量嚴(yán)重下降，隨著感病年數(shù)的增加，病情逐漸加深，直至整株干枯、死亡（圖1）。

2.2 新疆杏褪綠卷葉植原體16S rDNA巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果 ?利用植原體通用引物對(duì)R16mF2/R16mR2對(duì)杏褪綠卷葉病、棗瘋病病株和健康杏樹植株總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，棗瘋病病株總DNA可以擴(kuò)增出1條約1.5 kb的特異性片段，而杏褪綠卷葉病病株、健康杏樹植株和滅菌超純水空白對(duì)照均未出現(xiàn)特異性條帶（圖2a）。進(jìn)一步以杏褪綠卷葉病病株第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)側(cè)引物對(duì)R16F2n/R16R2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出約1.2 kb的特異性片段，同時(shí)棗瘋病植原體也擴(kuò)增出相同的特異性條帶，而健康植株和滅菌超純水均未出現(xiàn)特異性條帶（圖2b）。結(jié)果表明，所用引物對(duì)具有特異性，可從疑似病樣中擴(kuò)增到與目的基因片段大小相符的條帶。疑似病樣中存在植原體。

2.3 杏樹褪綠卷葉植原體16S rDNA片段的序列分析

隨機(jī)選取6個(gè)杏褪綠卷葉病病樣的巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化、克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，從6個(gè)病樣中獲得的片段大小均為1 248 bp，G+C含量為45.91%～45.99%，符合植原體16S rDNA基因G+C含量（45%～49%），命名為ACLR-XJ01～ACLR-XJ06，登錄號(hào)分別為（MH587702～MH587707）。

同源性比較結(jié)果表明，新疆杏褪綠卷葉植原體不同分離株16S rDNA基因片段核苷酸序列無(wú)明顯差異，相似性達(dá)到99.8%～100%。與植原體16Sr各組代表性植原體比較結(jié)果表明，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物ACLR-XJ01～ACLR-XJ06與植原體16SrⅤ組成員的相似性達(dá)到97.6%以上，與16SrⅤ-B亞組的棗瘋病植原體山東寶山分離物BS1（EU999737），甜櫻桃綠化植原體山東分離物SCV-JN-2013（MF848965）相似性最高，均達(dá)到99.4%～99.6%。其中BS1和SCV-JN-2013與ACLR-XJ01～ACLR-XJ04僅有5個(gè)堿基的差異，與ACLR-XJ05和ACLR-XJ06有8個(gè)堿基的差異。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化及虛擬RFLP分析

將本研究獲得的6個(gè)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物16S rDNA序列與GenBank中已公布的部分16Sr組代表性植原體16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，利用MEGA 5.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖3），杏褪綠卷葉植原體新疆分離物ACLR-XJ01～ACLR-XJ06與16SrⅤ組各亞組代表性植原體成員聚在同一進(jìn)化分枝上，屬于16SrⅤ組成員。同時(shí)與16SrⅤ-B亞組各株系的親緣關(guān)系最近，聚在一個(gè)分枝上，但又單獨(dú)聚為一簇。進(jìn)一步利用植原體在線分類系統(tǒng)iPhyClassifier對(duì)6個(gè)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物進(jìn)行虛擬RFLP分析，結(jié)果表明，本研究獲得的植原體16S rDNA基因片段的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性不同于已有的16Sr組/亞組。其中與16SrⅤ-B亞組分離物（GenBank登錄號(hào)：AB052876）的相似性最高，相似系數(shù)為0.94，在限制性內(nèi)切酶BstU I和Rsa I的酶切位點(diǎn)上存在明顯的差異，因此系統(tǒng)推測(cè)本研究獲得的杏褪綠卷葉植原體新疆分離物可能屬于16SrⅤ組的一個(gè)新亞組。

3 討論

依托特殊生態(tài)地理環(huán)境所賦予的豐富光熱資源，新疆杏有著優(yōu)異的品質(zhì)。近年來(lái)，新疆杏生產(chǎn)規(guī)模快速擴(kuò)大和迅猛發(fā)展，形成了環(huán)塔克拉瑪干沙漠獨(dú)特的杏生態(tài)品種群和杏產(chǎn)業(yè)帶，對(duì)于地處極端干旱荒漠區(qū)、生態(tài)環(huán)境極為脆弱的南疆地區(qū)防風(fēng)固沙、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都有著重要的意義。杏褪綠卷葉病自2007年首次在新疆出現(xiàn)以來(lái)，已從零星發(fā)生轉(zhuǎn)為成片發(fā)生，發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，部分成年果園的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，給新疆杏生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重隱患。本研究利用巢式PCR 擴(kuò)增、序列分析、同源性比較等分子生物學(xué)方法對(duì)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物進(jìn)行分子檢測(cè)鑒定，獲得了其16S rDNA分子信息，從亞組水平上確定了其分類地位，為建立新疆杏褪綠卷葉植原體快速診斷和檢測(cè)提供技術(shù)支持。

近年來(lái)國(guó)際上對(duì)ACLR的病原、流行學(xué)、寄主范圍、檢驗(yàn)檢疫等方面開展了不少研究，取得了一定進(jìn)展[16-17]。盡管不同國(guó)家所報(bào)道的杏褪綠卷葉病癥狀相似，但各國(guó)所報(bào)道的ACLR病原包括分類地位不同的多種植原體。如捷克、土耳其、比利時(shí)、白俄羅斯等國(guó)發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrⅩ-B亞組[18-21]，黎巴嫩、德國(guó)發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrⅠ-F亞組[22-23]，伊朗發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrⅡ-C亞組[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)，ACLR病原與蘋果叢枝植原體（apple proliferation phytoplasma，16SrⅩ-A）、梨衰退植原體（pear decline phytoplasma，16SrⅩ-C）和翠菊黃化植原體（aster yellow phytoplasma，16SrⅠ-A）具有相似的DNA序列，序列相似度為98.6%～99.1%，差異部位在16S rDNA第16～19位點(diǎn)，但傾向于將杏褪綠卷葉植原體歸于蘋果叢枝病植原體類群[25]。而本研究發(fā)現(xiàn)，引起新疆杏褪綠卷葉病的植原體在系統(tǒng)分類上應(yīng)歸于16SrⅤ組。由此可見，杏樹可被多種植原體侵染并引起相似的癥狀，而新疆杏褪綠卷葉病株中是否還有其他不同分類地位的植原體，是否存在混合侵染現(xiàn)象還有待進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)。

植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier在植原體亞組及株系的分類研究中已得到廣泛應(yīng)用。本研究利用該方法對(duì)患病杏樹植株中植原體的16S rDNA序列進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)16S rDNA基因片段的限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性不同于所有已建立的16Sr組/亞組的參考模型。其中與16SrⅤ-B亞組分離物（GenBank登錄號(hào)：AB052876）的相似性最高，相似系數(shù)為0.94（相似系數(shù)≤0.97建議該植原體可代表新的植原體16Sr亞組[8]），因此推測(cè)本研究獲得的杏褪綠卷葉植原體新疆分離物屬于16SrⅤ組的一個(gè)新亞組。通過對(duì)16S rDNA序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與16Sr V-B亞組的棗瘋病植原體山東分離株、甜櫻桃綠化植原體山東分離株親緣關(guān)系很近，序列相似性達(dá)到99.4%～99.6%，最多有8個(gè)堿基存在差異，且在同一條進(jìn)化小分支上，在分子水平上未體現(xiàn)出不同株系間的差異。隨著植原體分類的深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)僅依靠16S rDNA序列對(duì)植原體進(jìn)行分類鑒定存在嚴(yán)重的局限性，因此，有必要進(jìn)一步測(cè)定核糖體蛋白基因（rp）、延伸因子基因（tuf）、運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因（SecY）等較16S rDNA具有較大變異性的基因或區(qū)域以獲取更加豐富的分子生物學(xué)信息，從而更加深入了解杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與其他植原體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和分子水平差異，為植原體致病機(jī)制研究與新疆杏褪綠卷葉病的防治奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）