有關(guān)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的疑慮與剖析

洪長(zhǎng)根

PCR就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。雖然人教版教材僅用不到400個(gè)字和兩幅圖作了簡(jiǎn)單介紹，但基于PCR在基因工程中的重要地位，使得涉及到的訓(xùn)練越來(lái)越多、越來(lái)越難，相關(guān)的疑問和剖析大致有以下一些。

1 PCR原料是dATP、dTTP、dCTP、dGTP的原因

通過(guò)《必修2.遺傳與進(jìn)化>的學(xué)習(xí)，學(xué)生知道DNA復(fù)制的原料是四種脫氧核苷酸，但教材的圖1-8中卻出現(xiàn)了dATP、dTTP、dCTIP、dGTP。學(xué)生知道ATP是三磷酸腺苷，但不知道dATP、dTTP、dCTP、dGTP。其實(shí)dATP、dTTP、dCTP、dGTP指的是三磷酸脫氧核苷酸（dNTP），是合成脫氧核糖核酸的“最小單位”。DNA復(fù)制時(shí)，脫氧核苷酸鏈的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足夠的能量，而dNMP則做不到，用這種原料所完成的反應(yīng)不可逆且極易發(fā)生。因?yàn)楫?dāng)脫氧核苷酸鏈延伸一個(gè)一磷酸脫氧核苷酸（dNMP），生成焦磷酸（Fl4P207），然后焦磷酸在焦磷酸酶的催化下迅速分解為兩個(gè)磷酸，使得反應(yīng)的總吉布斯自由能大幅降低，這是細(xì)胞內(nèi)典型的焦磷酸解驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)之一。其他如糖原的磷酸解、tRNA與氨基酸的結(jié)合反應(yīng)也都是焦磷酸解驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)。

2 PCR-個(gè)周期的大約時(shí)間

PCR過(guò)程雖然經(jīng)過(guò)復(fù)性（90-95℃）、退火（55-60℃）、延伸（70-75℃）3個(gè)基本反應(yīng)步驟才能完成，但實(shí)驗(yàn)完成的時(shí)間卻只有2～4 min，也就是說(shuō)2--3 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

3 引物的概念及PCR過(guò)程使用引物的原因

在PCR技術(shù)中，擴(kuò)增目的基因的方法其實(shí)就是必修2中的DNA復(fù)制。那么，復(fù)制為什么要引物？這引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？復(fù)制完成后引物到哪里去了？……學(xué)生會(huì)產(chǎn)生出一串關(guān)于引物的疑問。

在PCR過(guò)程中之所以需要引物是因?yàn)樵贒NA復(fù)制中DNA聚合酶僅僅可以把新的脫氧核苷酸加到已有的DNA鏈上，據(jù)此可知：引物其實(shí)就是引子，是一小段單鏈DNA（體內(nèi)DNA復(fù)制所用的引物是RNA，RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在RNA引物3一OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段），是作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。

3.1 引物的長(zhǎng)度

DNA復(fù)制的引物為單鏈DNA，其長(zhǎng)度常用的是18-27個(gè)脫氧核苷酸，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的引物會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

3.2 引物的種類

DNA復(fù)制是以依解開的兩條鏈都作模板的，PCR也不例外，故PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)有兩種引物，即分別能與兩條模板鏈配對(duì)的兩種單鏈DNA。

3.3 需要引物的數(shù)量

引物雖然起的作用是開始進(jìn)行脫氧核苷酸鏈的延長(zhǎng)，但其本質(zhì)就是復(fù)制時(shí)所要合成的新鏈中的一段，完全沒有必要在DNA合成結(jié)束后脫下來(lái)再用于下個(gè)PCR周期（體內(nèi)DNA復(fù)制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。這就涉及到引物的消耗問題，如果擴(kuò)增的數(shù)量大，則的消耗的引物也多，具體數(shù)據(jù)應(yīng)該等于整個(gè)PCR過(guò)程中新合成的DNA單鏈數(shù)。

3.4 引物的結(jié)合位點(diǎn)

由于DNA復(fù)制只能是5'—3 '進(jìn)行，而DNA的兩條單鏈又是反向平行的，這就決定了兩種引物的結(jié)合位點(diǎn)是模板鏈的3端。如果一種在左側(cè)的話，另一種應(yīng)在右側(cè)。學(xué)生產(chǎn)生疑問的原因是必修2學(xué)到DNA復(fù)制產(chǎn)生的子代DNA是與親代DNA -模一樣的，這就意味著引物都應(yīng)該結(jié)合在模板3的起始端，但訓(xùn)練中涉及到PCR引物結(jié)合位點(diǎn)都不是3的起始端，如圖1所示。

為什么會(huì)出現(xiàn)這種差別？這是因?yàn)楂@取目的基因時(shí)，不可能（不容易找到這樣的限制酶）正好在目的基因的前后切下來(lái)，使得獲取的目的基因的前后端或多或少帶有一段多余的DNA片段，為了不讓多余的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，進(jìn)而跟著表達(dá)而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。即便沒有影響，也由于引物擴(kuò)增跨度一般以200-500 bp為宜，特定條件下才擴(kuò)增長(zhǎng)至10 kb的片段。所以，引物設(shè)計(jì)的結(jié)合位點(diǎn)一般是在目的基因起始序列附近。

4 PCR的過(guò)程中出現(xiàn)3種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的原因

4.1 以原始模板為模板合成的是長(zhǎng)鏈

從基因文庫(kù)中最初獲取的DNA經(jīng)熱分開后的就是兩條長(zhǎng)度最長(zhǎng)的原始模板，以此為模板合成新單鏈時(shí)。引物是從3端開始延伸，但引物前的模板（5端的一小段）不能被復(fù)制，復(fù)制的產(chǎn)物就是長(zhǎng)鏈。長(zhǎng)鏈比原始模板缺了一端的序列，因此，其長(zhǎng)度不如原始模板。

4.2 以長(zhǎng)鏈為模板合成的是短鏈

當(dāng)PCR進(jìn)入第二周期后，引物與新合成的長(zhǎng)鏈結(jié)合時(shí)，也不能從開始部位結(jié)合，因?yàn)樵寄０?端在上個(gè)周期復(fù)制時(shí)都復(fù)制出來(lái)了。由此可知，以長(zhǎng)鏈為模板復(fù)制出來(lái)的新鏈又比長(zhǎng)鏈短了一點(diǎn)，名為短鏈。

4.3 以短鏈為模板合成的也是短鏈

從第三個(gè)周期開始，將出現(xiàn)以短鏈為模板復(fù)制出的與短鏈等長(zhǎng)的新鏈，這樣復(fù)制出的子代DNA就是平時(shí)所說(shuō)的通過(guò)PCR克隆出來(lái)的目的基因。

5 PCR擴(kuò)增過(guò)程中各種DNA鏈的變化規(guī)律

在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，理論上講DNA分子總數(shù)為2''（n為PCR循環(huán)數(shù)），各種DNA單鏈總數(shù)為2×2''，但在實(shí)際反應(yīng)中并不能達(dá)到理論值。因?yàn)?，反?yīng)初期DNA片段的增加是正常的，但隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段的數(shù)量就會(huì)降下來(lái)甚至停止，這稱作平臺(tái)期。一般情況下正常的增長(zhǎng)大約是30個(gè)循環(huán)左右。好在訓(xùn)練也只涉及到最初幾個(gè)循環(huán)的計(jì)算，具體的變化規(guī)律如下。

5.1 原始模板鏈的數(shù)量

原始模板永遠(yuǎn)只有兩個(gè)。因?yàn)橐栽寄０鍨槟０鍙?fù)制出的新鏈?zhǔn)情L(zhǎng)鏈（其長(zhǎng)度比原始模板短一點(diǎn)）。

5.2 長(zhǎng)鏈的數(shù)量

既然用原始模板能復(fù)制出來(lái)的是長(zhǎng)鏈，原始模板又永遠(yuǎn)只有兩個(gè)，這樣就能保證每經(jīng)過(guò)一個(gè)反應(yīng)周期，長(zhǎng)鏈就可以增加2個(gè)。又由于以長(zhǎng)鏈為模板復(fù)制出的新鏈為短鏈（其長(zhǎng)度比長(zhǎng)鏈還短一點(diǎn)），二者合起來(lái)計(jì)算，長(zhǎng)鏈的變化規(guī)律是：PCR循環(huán)一次增加2條。

5.3 短鏈的數(shù)量

短鏈的情況有點(diǎn)復(fù)雜，從模板的角度分析的結(jié)果是以長(zhǎng)鏈為模板復(fù)制出的新鏈?zhǔn)嵌替?，?dāng)短鏈出現(xiàn)后，再以短鏈為模板復(fù)制出的新鏈也是短鏈;從時(shí)間的角度分析的結(jié)果是第一個(gè)反應(yīng)周期沒有短鏈產(chǎn)生，第二個(gè)反應(yīng)周期通過(guò)以長(zhǎng)鏈為模板首次復(fù)制出短鏈，到第三個(gè)反應(yīng)周期時(shí)，就會(huì)以兩種模板同時(shí)復(fù)制出短鏈。關(guān)于短鏈的數(shù)量變化可以認(rèn)為是按指數(shù)倍數(shù)增加的，但找不到一個(gè)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)式來(lái)表達(dá)，若要求某個(gè)反應(yīng)周期后的短鏈數(shù)，只能根據(jù)DNA單鏈總數(shù)、原始模板數(shù)和長(zhǎng)鏈數(shù)來(lái)推算。好在這三個(gè)數(shù)據(jù)都是簡(jiǎn)單而有規(guī)律的，相關(guān)推算可以參考圖2進(jìn)行。