西藏砂生槐EST—SSR引物開發(fā)及多態(tài)性檢測(cè)

符亞茹，李少珂，姚衛(wèi)杰，等(78)

摘要：砂生槐為青藏高原特有灌木種，具有重要生態(tài)價(jià)值。開發(fā)多態(tài)EST-SSR 引物對(duì)其居群遺傳多樣性研究及保護(hù)策略的制定具有重要意義。利用SciRoKo v3.4軟件對(duì)前期獲得的砂生槐轉(zhuǎn)錄組中146 943個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行掃描共發(fā)現(xiàn)9 428個(gè)SSR位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄本中的微衛(wèi)星種類十分豐富，其中以三核苷酸和五核苷酸重復(fù)最多，分別占SSR總位點(diǎn)數(shù)的33.32%和21.70%，重復(fù)次數(shù)主要集中在3～9次重復(fù)。其中（AG/CT）n、（GA/TC）n、（GAA/TTC）n、（AAAAT/ATTTT）n 重復(fù)基序最多，占總重復(fù)基序的4.50%、 4.34%、 3.13%和2.44%。本研究中設(shè)計(jì)130對(duì)EST-SSR引物，有80對(duì)擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最終有11對(duì)具有較高多態(tài)性，且對(duì)于30個(gè)模板得到的位點(diǎn)平均等位基因數(shù)為2.9；觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）平均值分別為0.423 9和0.336 4。

關(guān)鍵詞：砂生槐；轉(zhuǎn)錄本；EST-SSR；多態(tài)性；引物

中圖分類號(hào)： S718.43文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0078-04

收稿日期：2014-12-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31260189）；西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)——高原生態(tài)。

作者簡(jiǎn)介：符亞茹（1988—），女，陜西西安人，碩士研究生，主要從事高原植物分子生態(tài)研究。E-mail： fuyaruxw@126. com。

通信作者：李慧娥，博士，副教授，主要從事高原植物分子生物學(xué)研究。E-mail： lihuiesh@126.com。砂生槐[Sophora moorcroftiana （Benth.） Benth. ex Baker]為青藏高原特有豆科槐屬矮灌木。主要分布在青藏高原海拔2 800～4 400 m的西藏“一江兩河（雅魯藏布江、拉薩河、年楚河）”河谷寬谷段的沙質(zhì)地上，在雅魯藏布江寬河谷形成大片群落[1]。該樹種為青藏高原干旱河谷半固定沙地上的先鋒灌叢植物[2]。由于其極強(qiáng)的抗旱、防風(fēng)固沙特點(diǎn)，目前已成為青藏高原人工造林先鋒樹種，具有重要的生態(tài)價(jià)值。但由于砂生槐分布區(qū)的過度放牧及薪炭過度樵采等人為干擾，導(dǎo)致青藏高原獨(dú)有的砂生槐種群嚴(yán)重退化，甚至一些種群正逐步消失，為此對(duì)砂生槐的保護(hù)迫在眉睫。

基于遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的植物遺傳多樣性研究為資源保護(hù)提供了新的理論指導(dǎo)。分子標(biāo)記是遺傳多樣性研究的重要手段之一，常用DNA分子標(biāo)記中簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSR）[3]又稱微衛(wèi)星（microsatellite）[4]，因其具有共顯性分離、重復(fù)性強(qiáng)、DNA樣本用量少、位點(diǎn)專一且多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[5]，已廣泛運(yùn)用于植物遺傳多樣性分析中[6-9]。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)獲取了砂生槐的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GenBank 登錄號(hào)： SRP041237）[10]，這為成功開發(fā)砂生槐多態(tài)EST-SSR引物提供了前提，本研究則基于此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)用于分析砂生槐遺傳多樣性的多態(tài)EST-SSR引物。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

來自于青藏高原不同分布區(qū)的共30個(gè)砂生槐單株用于多態(tài)SSR引物開發(fā)。

1.2總DNA提取和檢測(cè)

取砂生槐葉片0.3 g，采用改良無液氮CTAB法[11]提取總DNA。瓊脂糖凝膠和微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000 C，美國(guó)）對(duì)其濃度和純度進(jìn)行精確檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SSR引物來源及引物設(shè)計(jì)

用高通量Illumina 2代測(cè)序技術(shù)對(duì)砂生槐RNA樣本進(jìn)行測(cè)序，得到clean data 數(shù)據(jù)。再利用CLC Genomics Workbench v6.5（CLC Bio， Denmark）軟件對(duì)高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接分析，最后用SciRoKo 3.4[12]軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR位點(diǎn)掃描。從中選取三重復(fù)基元最終設(shè)計(jì)并合成130對(duì)SSR引物用于多態(tài)引物篩選。

利用Primer Premier 6.0軟件，對(duì)含有SSR位點(diǎn)的EST序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為：GC含量40%～60%，退火溫度55～60 ℃，引物長(zhǎng)度范圍17～25 bp，擴(kuò)展片段長(zhǎng)度110～200 bp。

1.4PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系為20 μL：上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL （10 ng/μL），PCR擴(kuò)增Mix （康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）10 μL，超純水5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

用濃度為2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢查，查看是否有預(yù)期大小擴(kuò)增產(chǎn)物。然后對(duì)能擴(kuò)增出條帶的產(chǎn)物進(jìn)行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)[13]，以10 bp DNA maker （廣州東盛）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳后銀染[14]染色，在凝膠成像系統(tǒng)（GBOX-F3-E，英國(guó)）對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析，并照相保存。

1.5數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的遷移率，對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因片段長(zhǎng)度，獲得數(shù)據(jù)矩陣。用軟件PowerMarker v3.0[15]對(duì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（NA）、觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）、連鎖平衡（LD）和哈溫平衡（HWE）進(jìn)行檢測(cè)及評(píng)價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1砂生槐轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)掃描

用SciRoKo 3.4軟件默認(rèn)參數(shù)對(duì)146 943個(gè)砂生槐轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行掃描共發(fā)現(xiàn)9 428個(gè)SSR 位點(diǎn)，其SSR 數(shù)量、類型及頻率見表1，SSR中主要重復(fù)基元的類型及頻率見表2。由表1、表2可知，SSR種類豐富，且不同類型SSR出現(xiàn)頻率不同，除單核苷酸外，其他核苷酸重復(fù)所占總SSR比例從12.61%到33.32%；以三、五核苷酸重復(fù)為主，分別占SSR總數(shù)的33.32%和21.70%；其他類型所占比例相對(duì)較小，其中四核苷酸最少；重復(fù)次數(shù)主要集中在3～9次重復(fù)。從不同 SSR 基元出現(xiàn)頻率來看（表2），二核苷酸中以（AG/CT）n和（GA/TC）n為主，所占其重復(fù)基元的比例分別為33.41%和32.23%；三核苷酸種類豐富，其中以（GAA/TTC）n、（AAG/CTT）n和（AGA/TCT）n最多，分別占其重復(fù)基元的11.94%、7.61%、7.49%，其他較少；四核苷酸中以（AAAT/ATTT）n最多，占13.05%；另外五、六核苷酸分別以（AAAAT/ATTTT）n和（AAAAAT/ATTTTT）n最多；占總重復(fù)基元的主要重復(fù)基元類型是AG/CT （4.50%）、GA/TC（4.34%）、GAA/TTC （3.13%）和AAAAT/ATTTT（2.44%）。基于此掃描結(jié)果根據(jù)SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列共設(shè)計(jì)并合成130對(duì)引物供篩選。

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差異的SSR引物

首先用130對(duì)引物對(duì)2個(gè)來自不同分布區(qū)的砂生槐DNA模板進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示其中80對(duì)引物擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶（圖1）。用此80對(duì)引物對(duì)30個(gè)不同分布區(qū)的模板進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)（圖2），最終有41對(duì)引物對(duì)不同模板的擴(kuò)增顯示出差異，其中有19對(duì)差異變化較大，其引物信息見表3。

2.3多態(tài)SSR引物篩選

用PowerMarker 3.0軟件對(duì)表3中19個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其中8個(gè)SSR位點(diǎn)分析結(jié)果偏離哈溫平衡達(dá)極顯著水平。因此，最終篩選11個(gè)多態(tài)SSR位點(diǎn)，其等位基因數(shù)（NA）、觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）、連鎖平衡及哈溫平衡分析結(jié)果見表4。

3討論與結(jié)論

對(duì)于缺乏基因組信息的物種來說，欲開發(fā)應(yīng)用于遺傳多樣性的多態(tài)SSR引物成本高、耗時(shí)長(zhǎng)?；诟咄哭D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)多態(tài)EST-SSR引物具有開發(fā)成本低、操作簡(jiǎn)便、信息量大等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用[17]。砂生槐因其分布范圍狹窄、分布地交通不便等原因一直沒有相關(guān)基因組序列被公開報(bào)道，本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)的SSR引物表3砂生槐擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差異的EST-SSR引物中 61.5%能在基因組DNA上擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶，未成功擴(kuò)增的引物可能是由于：2條引物被內(nèi)含子隔開；引物位置恰好位于內(nèi)含子或外顯子剪切點(diǎn)；EST片段發(fā)生了變化等而導(dǎo)致無法有效擴(kuò)增。

砂生槐高通量轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星的種類非常豐富，從單核苷酸到六核苷酸都具有豐富的類型，其中以三核苷酸和五核苷酸重復(fù)為主，分別占SSR總數(shù)的33.32%和21.70%，目前在大多數(shù)物種如豌豆[18]、蘋果[19]、紅豆杉[20]、杜仲[21]等中，研究發(fā)現(xiàn)二核苷酸和三核苷酸是最常見的轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基序類型。主要重復(fù)基元的比較分析表明，二核苷酸中的

表411對(duì)砂生槐多態(tài)EST-SSR位點(diǎn)信息

位點(diǎn)NAHOHEP（Seq-Bon）Sm2430.509 40.700 00.039 0（0.007 3）Sm5030.235 00.266 71.000 0（0.050 0）Sm6920.444 40.400 00.702 0（0.025 3）Sm7730.539 40.500 00.144 0（0.012 7）Sm8220.497 80.266 70.007 0（0.006 4）Sm8550.570 60.233 30.000 0（0.004 6）Sm9540.501 70.366 70.002 0（0.005 1）Sm10120.432 80.300 00.097 0（0.010 2）Sm11230.399 40.266 70.087 0（0.008 5）Sm12230.212 80.133 30.004 0（0.005 7）Sm12720.320 00.266 70.303 0（0.017 0）Mean2.90.423 90.336 4 注：本表中所篩選的11個(gè)SSR位點(diǎn)為表3中加粗位點(diǎn)。

AG/CT重復(fù)，三核苷酸中的GAA/TTC重復(fù)，四核苷酸中的AAAT/ATTT重復(fù)和五核苷酸中的AAAAT/ATTTT重復(fù)在各類重復(fù)基元中所占比例最大，六核苷酸各重復(fù)類型所占的比例都較低，這與桑樹[23]較為相似。EST-SSR發(fā)生頻率和密度、重復(fù)基元類型在不同物種間存在較大差異，這可能與物種基因組組成、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法、數(shù)據(jù)量大小、微衛(wèi)星搜索標(biāo)準(zhǔn)等不同有較大的關(guān)系。物種三核苷酸基序數(shù)量較多可能是對(duì)自然選擇機(jī)制的一種積極響應(yīng)，這對(duì)物種的生存競(jìng)爭(zhēng)具有重要意義，且三核苷酸基序的SSR位點(diǎn)具有轉(zhuǎn)高的遺傳變異[22]，因此本研究主要選取三核苷酸基序的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分析。

對(duì)不同植物種類SSR位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，每個(gè)SSR位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)約為10.0，期望雜合度約為0.61[24]，本研究中，80對(duì)砂生槐EST-SSR嚴(yán)格控制分析結(jié)果后，最終有11對(duì)引物顯示出較高的多態(tài)性。在這11個(gè)位點(diǎn)中盡管Sm24和Sm77位點(diǎn)的遺傳多樣性相對(duì)于其他位點(diǎn)來說較高，但多數(shù)位點(diǎn)平均等位基因數(shù)和期望雜合度都低于上述平均值，這可能是因?yàn)槲墨I(xiàn)所列這2項(xiàng)指標(biāo)的平均值僅基于部分物種所得引起的偏差及砂生槐分布范圍狹窄所致。

綜上，利用砂生槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)多態(tài)EST-SSR引物是可行的，同時(shí)最終篩選出的這11對(duì)多態(tài)EST-SSR引物可以用于后期砂生槐天然居群遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)庫構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種、功能基因挖掘等研究中。

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