綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C誘導飛蝗中腸免疫功能分析

郭隆隆 李貝貝 李霜

摘要 為明確金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae胞外蛋白酶Pr1C在綠僵菌侵染飛蝗Locusta migratoria中腸中的作用，從綠僵菌IMI330189菌株轉錄組中獲得并分析了Pr1C基因全長序列，設計引物對該基因進行了克隆和原核表達。將表達的Pr1C蛋白與綠僵菌IMI330189混合后飼喂處理，測定了混合物對飛蝗的毒力，并通過熒光定量PCR檢測了飛蝗中腸免疫相關基因的表達情況。結果顯示，該基因屬于綠僵菌類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶家族，全長為2 126 bp，蛋白大小為71 kDa。Pr1C與綠僵菌IMI330189混合后可以顯著提高對飛蝗的毒力。熒光定量結果表明，Defensin， Persephone， Tube， Relish， Dredd 5個基因在各處理中表達量均呈現(xiàn)升高趨勢，其中Pr1C蛋白和綠僵菌混合處理的變化比其他處理組變化快，于第2天達到較高水平;綠僵菌處理變化較慢，于第6天達到最高水平。本研究表明，綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C可顯著提高綠僵菌毒力，促進綠僵菌侵染速率，為進一步研制和應用生物制劑防治飛蝗提供理論依據(jù)。

關鍵詞 綠僵菌; 胞外蛋白酶; 飛蝗; 毒力

中圖分類號： S 476.12 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019075

Abstract In order to explore the role of Metarhizium anisopliae in the midgut infection of Locusta migratoria， the full-length sequence of Pr1C gene was obtained from the transcriptome sequences of M. anisopliae strain IMI330189 and primers were designed to clone and express the Pr1C gene. The obtained Pr1C protein was mixed with M. anisopliae IMI330189 spore and its toxicity to the locust was checked by using bait-feeding method. The expression level of intestinal immune-related genes in locusts was detected by fluorescence quantitative PCR. NCBI Blast results showed that Pr1C gene belonged to the serine protease family of M. anisopliae with a full length of 2 126 bp， and its protein size was 71 kDa. The bioassay results showed that the mixture of Pr1C and M. anisopliae IMI330189 could significantly increase the virulence to L. migratoria. The expression level of five genes Defensin， Persephone， Tube， Relish and Dredd showed an increasing trend in all treatments， but the treatment with the mixture of Pr1C protein and metarhizium induced a faster change than other treatments and reached to the highest level on the second day. The treatment with M. anisopliae induced slow change in the expression of genes， and the highest level was observed on the sixth day. This study indicated that the extracellular protease Pr1C of M. anisopliae could significantly increase the virulence of M. anisopliae and its infection rate， providing a theoretical basis for the further development and application of biological preparations for controlling L. migratoria.

Key words Metarhizium anisopliae; extracellular protease; Locusta migratoria; virulence

金龜子綠僵菌 Metarhizium anisopliae作為一種廣泛存在的昆蟲病原真菌能夠寄生于多種害蟲，它主要通過穿透昆蟲體表進入寄主體內，消耗營養(yǎng)，產生毒素等方式致死害蟲[1]。Kucera在昆蟲體壁離體誘導培養(yǎng)條件下首次發(fā)現(xiàn)了綠僵菌胞外蛋白酶的活性，并指出菌株的蛋白酶活力與其毒力存在關系[2]。樊美珍等利用該方法，以馬尾松毛蟲作為試蟲，測定了球孢白僵菌胞外蛋白酶的產量與毒力的關系，進一步證實二者之間存在相關性[3]。St Leger等研究發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白酶Pr1作為一組堿性同工酶[4]，能夠作用于昆蟲表皮中的天冬氨酸和谷氨酸的羧基，降解蛋白質[5]，在綠僵菌對昆蟲致病力方面發(fā)揮著重要的作用[6]。St Leger等通過構建超表達Pr1A基因的菌株，發(fā)現(xiàn)其對昆蟲的致病力顯著高于野生型菌株[7]; Pr1A和Pr1B基因缺失的自發(fā)突變體菌株毒力明顯降低[8]。證明Pr1是綠僵菌中重要的毒力因子。

Quesada等研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌胞外蛋白抽提物經口飼喂后會引起海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis死亡及中腸結構破壞[9]。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，綠僵菌餌劑處理飛蝗，可導致飛蝗中腸微絨毛變形腫脹、斷裂脫落逐漸稀疏[10]。而飼喂含有綠僵菌和胰凝乳蛋白酶抑制劑（TPCK，Pr1的抑制劑）的飛蝗中腸微絨毛結構完整，未發(fā)生脫落變形等現(xiàn)象[11]。通過測定金龜子綠僵菌IMI330189的轉錄組發(fā)現(xiàn)在該菌株中存在包括Pr1C在內的多個Pr1基因。為明確Pr1C基因的功能，本研究以金龜子綠僵菌IMI330189為試驗材料，從中分離、克隆了胞外蛋白酶Pr1C基因，測定了Pr1C對綠僵菌的增效作用及其對蝗蟲免疫相關基因表達的影響， 為進一步明確其在綠僵菌破壞寄主中腸中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金龜子綠僵菌IMI330189保存于中國農業(yè)科學院植物保護研究所。在 28℃條件下，用 PDAY 培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，刮下分生孢子干燥后于4℃保存。使用前測定孢子含量及萌發(fā)率[12]，計算活孢子含量。

1.2 供試蟲源

試驗所用飛蝗 Locusta migratoria種群為本實驗室飼養(yǎng)純化種群。飛蝗卵在人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，孵化條件為：溫度（30±2）℃，濕度60%，L∥D=16 h∥8 h。將同一時間孵化、大小一致的蝗蝻轉移到養(yǎng)蟲籠（60 cm×50 cm×60 cm）中用新鮮麥苗飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：L∥D=16 h∥8 h，溫度（30±2）℃，相對濕度60%。

1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，補水定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min。

PDAY 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮煮汁）200 g，瓊脂 20 g，蔗糖 20 g，酵母粉 5 g，補水定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌 25 min。

萌發(fā)培養(yǎng)基：蔗糖 2 g，瓊脂粉 1.8 g，補水定容至 100 mL， 121℃高壓滅菌 15 min。

菌絲生長培養(yǎng)基：硫酸鎂 2 g，酵母粉 10 g，蔗糖 20 g，磷酸氫二鉀 5 g，補水定容至1 000 mL， 121℃高壓滅菌 15 min。

1.4 主要試劑及儀器

試劑主要包括TransZol Up Plus RNA Kit（全式金），PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），DL2000 DNA marker（TaKaRa），RNA spin column（全式金），ProteinIso ?His-Tag Resin（全式金），Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell（全式金），無核酸酶水（Ambion），膠回收試劑盒（Axygen），質粒提取試劑盒（Axygen），Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa），氯仿、無水乙醇、異丙醇、丙三醇（國產分析純）等。本文所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

儀器主要包括智能人工氣候箱（寧波賽福），超凈工作臺（上海博迅），東勝龍ETC-811PCR儀，德國Sigma3K15冷凍離心機，THZ-D臺式恒溫振蕩器（華美生化儀器廠），HPX-9052MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博迅），ABI Fast 7500熒光定量PCR儀等。

1.5 Pr1C基因克隆與表達

利用菌絲生長培養(yǎng)基培養(yǎng)綠僵菌，使用TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）從綠僵菌菌絲中提取樣品總RNA，PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄樣品cDNA。通過上、下游引物F1： 5′-ATTTAATGTGCAAAGCCGGTG-3′和R1： 5′-CAGATGCTCAGGACGAGAAAGT-3′對Pr1C基因進行PCR擴增。擴增條件為95℃ 3 min;95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，36個循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。擴增后的目的產物進行回收，與pMD-19-T Easy載體連接。然后，通過熱激法將連接產物轉入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細胞，利用氨芐抗性篩選陽性菌株。陽性克隆經PCR檢驗正確后，由上海生工生物（北京）公司測序。

從測序確認無誤的轉化子中提取質粒，并以此為模板，通過含有Nde I和Sal I酶切位點的引物F2： 5′-GGAATTCCATATGGACTGCAACGGTCAC-3′（Nde I）和R2： 5′-ACGCGTCGACATTGTGTCCCCTTTCGACTC-3′（Sal I）進行PCR，擴增Pr1C全長基因片段，PCR擴增條件為：95℃ 3 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，36個循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。將PCR產物純化回收后進行雙酶切（Nde I/Sal I），酶切、回收后的片段與pET-21b載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，利用氨芐抗性篩選陽性克隆。從篩選出的陽性克隆中提取質粒，進行雙酶切、PCR鑒定。將驗證正確的單克隆進行誘導表達，檢測目的蛋白Pr1C的表達情況。

挑取含有pET-21b-Pr1C質粒的大腸桿菌單菌落，37℃、220 r/min、活化培養(yǎng)12 h后，吸取4 mL加入含有200 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)2 h;然后加入IPTG，終濃度為0.5 mmol/L，20℃、150 r/min誘導培養(yǎng)8 h。7 000 r/min離心，收集菌體。加入20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液懸浮菌體。在400 W，工作5 s，間隔5 s超聲破碎菌體細胞15 min，獲得所需目的蛋白產物。

目的蛋白含量測定采用 Bradford考馬斯亮藍方法，以牛血清白蛋白為標準蛋白，用酶標儀在 595 nm 處讀取 OD值，計算樣品蛋白含量。

1.6 對飛蝗的毒力測定

1.6.1 試驗處理

試驗共設3個處理，分別為：1）濃度為1.8 mg/mL的Pr1C蛋白;2）孢子含量2.5×108 個/g的綠僵菌IMI330189;3）濃度為1.8 mg/mL的Pr1C蛋白+孢子含量2.5×108 個/g的金龜子綠僵菌IMI330189。以大腸桿菌BL21（DE3）（含有pET-21b空載體）誘導表達的菌體作為空白對照。所有處理和對照都設5次重復。

1.6.2 餌劑的配制

稱取適量麥麩，加入5%（V/m）植物油，混勻。根據(jù)不同處理每克麥麩中綠僵菌孢子粉和Pr1C蛋白的含量、綠僵菌孢子粉中孢子含量及萌發(fā)率、Pr1C蛋白溶液的濃度，計算不同處理中所需加入綠僵菌孢子粉和Pr1C蛋白的量，進行稱量，分別加入含有植物油的麥麩中，混勻。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 生物測定

將預先饑餓 12 h 的飛蝗3齡若蟲放入無菌的塑料筐中（長×寬×高=30 cm×12 cm×9 cm），每筐 30 頭，用已消毒的玻璃板蓋好。將混合好的餌劑按每30頭（1筐）4 g的量盛放在滅菌的培養(yǎng)皿中，然后放入有蝗蟲的塑料筐中，每個處理重復5 次?；认x取食 24 h 后，將餌劑取出，換成新鮮麥苗。每天記錄蝗蟲死亡數(shù)和存活數(shù)，連續(xù)記錄10 d，計算每天死亡率和存活率，并繪制存活率折線圖。

1.7 基因熒光定量檢測

按照1.6.1相同的處理和重復進行設計，對照組及處理組取食餌劑 24 h 換成麥苗后開始第 1 次取樣，然后每間隔1 d取樣，共取4次。每個重復中取活蟲1頭，每個處理共取活蟲 5頭，切取中腸， 0.75%的生理鹽水清洗，中腸樣品液氮速凍后放于-80℃冰箱保存。用TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）提取中腸總RNA樣品，PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄獲得cDNA，設計熒光定量PCR引物（表1），對飛蝗免疫途徑相關基因Dredd、Defensin、 Persephone、 Relish、 Tube表達量進行檢測，內參選用β-actin。反應程序為：95℃預變性2 min;95℃ 15 s，58℃ 15 s，68℃ 30 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCT法分析不同處理后飛蝗免疫基因表達量變化。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

蝗蟲存活率計算方法如下：存活率=存活數(shù)/總數(shù)×100%，存活率統(tǒng)計結果采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，分析結果采用GraphPad Prism 6軟件進行圖表制作。2 結果與分析

2.1 綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C基因序列分析

對胞外蛋白酶Pr1C序列分析結果顯示，該基因序列全長2 124 bp，編碼含有707個氨基酸的蛋白序列，該基因與類枯草桿菌蛋白酶具有很高的同源性，達到97%，序列中含有肽酶S8家族結構域（Peptidases_S8_5）酶家族（絲氨酸蛋白酶家族）結構域（Peptidases_S8）， Ⅶ型分泌型絲氨酸蛋白酶肌球蛋白 （type Ⅶ secretion-associated serine protease mycosin），F(xiàn)n3類結構域（fn3_5），類PoS1蛋白酶相關結構域等保守結構域（圖1）。

2.2 綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C原核表達載體構建及轉化

通過PCR從綠僵菌cDNA中擴增獲得了2 124 bp的Pr1C基因片段，將其連接到pMD-19-T Easy載體，獲得了4 816 bp的重組質粒pMD-19-T-Pr1C。以其為模板，采用引物F2、R2進行PCR擴增，獲得了含有Nde I和Sal I雙酶切位點的Pr1C基因片段，經Nde I和Sal I雙酶切后插入到pET-21b載體相應的酶切位點間，獲得7 567 bp的重組表達質粒pET-21b-Pr1C（圖2），然后將質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中。經氨芐抗性篩選，獲得了含有重組質粒pET-21b-Pr1C的轉化子。從轉化子中提取質粒進行PCR和酶切驗證，證明插入的目的片段正確。用IPTG對目的基因片段進行誘導表達，結果該轉化子可以表達出71 kDa的Pr1C蛋白（圖2）。

2.3 綠僵菌IMI330189與Pr1C處理后飛蝗存活率檢測 ?結果顯示，隨著時間的延長，飛蝗的存活率整體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在對照中，飛蝗的存活率一直維持在較高的水平，從第1天到第10天，存活率只降低了10.0%（存活率為90.7%）。在綠僵菌處理中，由于綠僵菌的侵染導致飛蝗不斷死亡，飛蝗的存活率逐漸降低，到第10天，降低到60.7%。Pr1C處理與綠僵菌處理結果類似，到第10天，飛蝗的存活率降低到63.3%，二者之間沒有顯著差異（P>0.05），但與對照組相比，差異顯著 （P<0.001）。將綠僵菌與Pr1C混合后，飛蝗的存活率迅速下降，到第10天降低到只有30.0%，與其他處理間存在顯著差異。

2.4 飛蝗中腸免疫途徑下游相關基因檢測

熒光定量檢測結果（圖4）顯示，飛蝗取食餌劑后，中腸內5個免疫相關基因表達量水平總體呈升高趨勢。綠僵菌處理中，免疫基因在處理后第2天呈現(xiàn)出微弱上升，第4天表達量增長較多，到第6天時表達量達到最高;Pr1C蛋白處理組中免疫基因在處理后第2～4天表達量與綠僵菌處理組基本一致，第4～6天5個基因表達量與第2～4天相比呈現(xiàn)出穩(wěn)定的增長趨勢，但顯著低于其他處理（P<0.01）;綠僵菌和Pr1C蛋白混合處理后，免疫基因在第2天即呈現(xiàn)出較高的表達量，第2～4天增長最快，第4天5個基因表達量與其他處理組相比存在極顯著差異（P<0.001），然而到第6天時5個基因表達量明顯低于綠僵菌單獨處理，可見綠僵菌和Pr1C蛋白混合處理短時間內能夠顯著增加綠僵菌毒力，促進綠僵菌入侵寄主，并能引起寄主強烈的免疫反應。

3 討論

昆蟲的消化道作為其主要的營養(yǎng)消化和吸收場所，在昆蟲的生長發(fā)育中起著重要的作用，中腸作為分泌消化酶、消化食物和吸收養(yǎng)分的主要部位[13]，一直以來都受到人們的廣泛關注。本文通過體外表達綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C，并采用人工飼料飼喂的方式對飛蝗進行處理，結果發(fā)現(xiàn)綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C和綠僵菌混合作用的處理中，飛蝗死亡率明顯高于單獨處理。并且，綠僵菌胞外蛋白酶單獨作用的處理中死亡率達到了36.7%。曹偉平等采用飼喂方式處理棉鈴蟲幼蟲的試驗發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌經消化道侵染后可導致寄主中腸微絨毛脫落嚴重，腸壁組織溶解，表皮下細胞被菌絲侵染等現(xiàn)象[14]。王正浩通過飼喂飛蝗蛋白酶抑制劑的試驗發(fā)現(xiàn)，食用綠僵菌的飛蝗中腸微絨毛結構遭到破壞，加入TPCK后的飛蝗中腸微絨毛結構未發(fā)生明顯的破壞[11]。根據(jù)這一結果推測飛蝗食用含有綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C人工飼料后，之所以能夠導致飛蝗較高的死亡率，可能的原因是，取食含有胞外蛋白酶的人工飼料后，導致飛蝗中腸微絨毛結構脫落，表皮結構遭到破壞，影響飛蝗正常的取食作用，并影響飛蝗營養(yǎng)吸收，最終使得飛蝗死亡率升高。由此我們也可以得出結論，飛蝗在取食了含有綠僵菌和胞外蛋白酶Pr1C的人工飼料后的2～3 d內，胞外蛋白酶破壞中腸微絨毛結構，并導致中腸表皮結構破壞，破壞后的中腸表面有利于綠僵菌分生孢子的附著，且分生孢子更容易吸收蟲體營養(yǎng)物質，從而促進了綠僵菌的侵染，這使得綠僵菌和胞外蛋白酶混合使用的處理組死亡率明顯高于其他處理。

Toll和免疫缺陷途徑（IMD，immune deficiency pathways）作為主要的免疫途徑，在蝗蟲免疫中起重要作用[15-17]。綠僵菌在侵染過程中釋放毒力因子，與寄主Persephone蛋白結合，激活Toll途徑中SPE轉變?yōu)镾ptzle，有活性的Sptzle與Toll受體胞外域結合從而促進Toll途徑的激活，使下游髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）參與免疫反應促進Tube、Pelle基因的表達，并最終導致核轉錄因子κB（NF-κB）相關的轉錄調控因子Dif的磷酸化反應，促進抗菌肽的表達進而抵抗病原菌的入侵[18]。IMD途徑作為與Toll途徑協(xié)同作用的免疫反應，在病原真菌入侵過程中由寄主防御過程中大量的活性氧簇（ROS）的釋放而激活該免疫反應，IMD途徑的激活引發(fā)下游死亡相關結構域蛋白（Fadd）和死亡相關的類ced-3/Nedd2細胞凋亡蛋白酶（Dredd）基因表達，該基因的表達促進核轉錄因子κB（NF-κB）和轉錄因子Relish基因表達[19]，Relish的大量表達促進抗菌肽的產生抵抗病原菌的入侵[20-21]。防御素（defensin）是一種富含半胱氨酸的肽類物質，擁有抵抗革蘭氏陽性菌和參與昆蟲抗菌防御反應的作用[22]，在昆蟲免疫反應中同樣也起到至關重要的作用。在對飛蝗飼喂了含有Pr1C和綠僵菌的餌劑后，對飛蝗中腸免疫基因的表達量變化進行檢測后發(fā)現(xiàn)，在IMD途徑中Dredd、Relish兩個基因表達量均上調，Toll途徑中Tube、Pelle兩個基因表達量上調，由此可見在綠僵菌入侵中腸過程中Toll途徑和IMD途徑均參與蝗蟲中腸的免疫反應，使得下游免疫基因表達量升高，從而促進抗菌肽的產生引發(fā)蝗蟲中腸免疫反應。

本研究表達了綠僵菌胞外蛋白酶Pr1C，通過人工飼料飼喂的方式對該蛋白酶作用進行了生物學檢測，并對飛蝗存活率和免疫基因進行了轉錄水平的檢測，后期還需要深入研究該蛋白在飛蝗免疫中的作用機制。根據(jù)本試驗研究結果可以發(fā)現(xiàn)，綠僵菌胞外蛋白酶在對綠僵菌侵染飛蝗的過程中發(fā)揮著有效的促進作用，因此值得進一步開展作用機理及開發(fā)利用研究。

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（責任編輯： 田 喆）