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    香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺毒力及乙酰膽堿酯酶和Na+—K+—ATPase活性的影響

    2017-09-16 17:02:34陳新華萬(wàn)煒馮淑軍段立清
    農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2017年16期
    關(guān)鍵詞:毒力

    陳新華+萬(wàn)煒+馮淑軍+段立清

    摘 要:研究香茅油(Citronella oil)對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)(Aphis sp.)的毒力及乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)和Na+-K+-ATPase活性的影響,為尋找無(wú)公害防治枸杞蚜蟲(chóng)的方法提供理論依據(jù)。采用玻璃管藥膜法進(jìn)行生物測(cè)定,評(píng)估其對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的毒力。測(cè)定其對(duì)蚜蟲(chóng)離體AChE和Na+-K+-ATPase活性的影響。香茅油的LC50為11.97mL/L,對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)離體AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用,其中對(duì)Na+-K+-ATPase活性表現(xiàn)為低濃度促進(jìn),高濃度抑制。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)有觸殺毒力,對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)離體AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用。

    關(guān)鍵詞:香茅油;毒力;枸杞蚜;乙酰膽堿酯酶;Na+-K+-ATPase

    中圖分類號(hào):S482 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20170833060

    枸杞(Lycium barbarum L.)為茄科多年生落葉灌木,是著名藥用植物和出口產(chǎn)品(張宗山等,2007),又是國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食同源品種。枸杞蚜(Aphis sp.)是枸杞的重要害蟲(chóng)之一,成蟲(chóng)、若蟲(chóng)刺吸危害枸杞嫩葉、花蕾、幼果、生長(zhǎng)點(diǎn),在我國(guó)枸杞栽培區(qū)發(fā)生面積大、危害重,造成枸杞大量減產(chǎn)。且化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用,使農(nóng)藥殘留日漸加重,嚴(yán)重破壞了枸杞的品質(zhì),直接危害人體健康,加大了寧夏枸杞進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的難度。因此,目前對(duì)高效、低毒、低殘留、對(duì)環(huán)境污染小的生物制劑的需求非常迫切,從植物中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥活性物質(zhì),開(kāi)發(fā)新型無(wú)公害農(nóng)藥是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑。植物精油對(duì)昆蟲(chóng)具有熏蒸、觸殺、驅(qū)避、抑制生長(zhǎng)發(fā)育的作用。Enan研究表明,精油主要作用于昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng),AChE和Na+-K+-ATPase均與昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。關(guān)于香茅油的趨避、抑菌、殺蟲(chóng)作用已有報(bào)道,故探討香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的毒力及對(duì)AChE及Na+-K+-ATPase的影響,為深入研究香茅油的殺蟲(chóng)機(jī)理提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 供試?yán)ハx(chóng)

    枸杞蚜蟲(chóng)(Aphis sp.)采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)栽培的未經(jīng)任何農(nóng)藥處理的枸杞植株上。

    1.2 試劑

    香茅油(單方精油),ATPase測(cè)試盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所),丙酮、考馬斯亮藍(lán) G250、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖、氯化鈉。

    1.3 生物測(cè)定

    將香茅油用丙酮稀釋成經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的不同濃度梯度,丙酮作為對(duì)照。用玻璃管藥膜法(魯艷輝等,2009)測(cè)定其對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺作用。吸取300L藥液加入直徑1.5cm、高8cm的指形管內(nèi),迅速轉(zhuǎn)動(dòng),使藥液均勻涂布與指形管內(nèi),待丙酮揮發(fā)后接入待測(cè)蚜蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定。每管接入大小一致的無(wú)翅成蚜30頭,室溫下4h、12h后開(kāi)始觀察記錄死亡蟲(chóng)數(shù)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。死亡標(biāo)準(zhǔn)以毛筆撥動(dòng)蟲(chóng)體,不動(dòng)者記為死亡。

    1.4 酶液的制備及酶活性的測(cè)定

    1.4.1 AChE酶液的制備及酶活性的測(cè)定

    枸杞蚜蟲(chóng)AChE酶液制備參見(jiàn)高希武的方法,將200頭未經(jīng)任何處理的健康蚜蟲(chóng)置于玻璃勻漿器中,加入預(yù)冷的0.1mol/L pH值為7.6的磷酸緩沖液,冰預(yù)勻漿,勻漿液于12000rmp 4℃下離心15min,取上清液作為酶源,低溫保存待用。

    取待測(cè)酶液0.1mL酶液與0.1mLASCh混合,30℃水浴保溫15min后,加入DTNB顯色劑顯色并終止反應(yīng),于412nm下測(cè)定OD值。用丙酮將供試藥劑稀釋成所需濃度,向酶促反應(yīng)階段的反應(yīng)體系中加入酶液和藥劑,其他步驟同AChE酶活力測(cè)定。按下面的公式計(jì)算抑制率:

    酶的抑制率(%)= ×100%

    1.4.2 Na+-K+-ATPase酶液的制備及酶活性的測(cè)定

    枸杞蚜蟲(chóng) Na+-K+-ATPase酶液制備參見(jiàn)Feng等的方法,并有改進(jìn)。將200頭未經(jīng)任何處理的健康蚜蟲(chóng)置于玻璃勻漿器中,加2mLTris-HCl緩沖液,冰浴下勻漿。勻漿液于4℃,3000g下離心10 min,取上清液于10000g離心30 min,棄去上清液,沉淀用上述緩沖液溶解后作為酶源。按ATPase測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明測(cè)ATPase活性定。ATPase活力單位為μmolPi/mg prot/hour,試驗(yàn)重復(fù)3次。

    用丙酮將供試藥劑稀釋成所需濃度,向酶促反應(yīng)階段的反應(yīng)體系中加入酶液和藥劑,測(cè)定藥劑對(duì)枸杞蚜 Na+-K+-ATPase活性的影響,計(jì)算抑制率。

    ATPase活力=×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×6×7.8÷待測(cè)樣本蛋白濃度

    注:標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.02μmol/ml; 6:定義上為每小時(shí),實(shí)際操作10min反應(yīng),所以必須乘以6;7.8:反應(yīng)體系中7.8倍稀釋。

    1.5 酶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

    參照Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    測(cè)定數(shù)據(jù)采用EXCEL和POLO軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)算致死中濃度(LC50)值以及抑制率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的觸殺毒力

    LC50值是用來(lái)衡量藥劑室內(nèi)毒力效果大小的指標(biāo),LC50越小,表明毒力效果越好,處理4h、12h香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)的LC50分別為11.97(9.86~16.40)mL/L和3.35(2.53~4.04)mL/L(表1),說(shuō)明香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)具有觸殺毒力。香茅油不同濃度對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)死亡率的影響見(jiàn)圖1,濃度與死亡率成正比例關(guān)系,即死亡率隨著濃度的增大而增大。濃度為10mL/L條件下,處理4h、12h的死亡率分別為48.45%和95.56%。

    2.2 香茅油對(duì)AChE活性的影響endprint

    在離體條件下,香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)AChE活力的影響見(jiàn)表2,可以看出,對(duì)照枸杞蚜蟲(chóng)AChE活力最高,為1.44±0.01mmol/min·mgpro;香茅油濃度為10mL/L時(shí),枸杞蚜蟲(chóng)AChE活力最低。香茅油各濃度處理的枸杞蚜蟲(chóng)AChE活力均與對(duì)照存在顯著差異(P<0.05)。精油濃度與抑制率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,即隨著精油濃度的增加,對(duì)蚜蟲(chóng)AChE抑制率增加。以對(duì)照的比活力值為1,香茅油濃度在2、4、6、8、10mL/L時(shí),對(duì)應(yīng)的比活力比值分別為0.84、0.75、0.71、0.60、0.55。

    2.3 香茅油對(duì)Na+-K+-ATPase活性的影響

    香茅油濃度為2ml/L時(shí),對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)Na+-K+-ATPase的抑制率為負(fù)值,說(shuō)明香茅油濃度為2ml/L時(shí)對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)離體Na+-K+-ATPase活性表現(xiàn)為激活作用,香茅油濃度為4、6、8、10ml/L對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)Na+-K+-ATPase有抑制作用,且抑制作用隨著濃度的升高而增大。

    3 結(jié)論與討論

    香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)具有觸殺毒力,且死亡率隨著濃度的增大而增大,處理12h的死亡率達(dá)到95.56%。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)AChE活性具有顯著抑制作用,且濃度與抑制率呈正相關(guān)。香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)Na+-K+-ATPase活性影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制。

    萬(wàn)樹(shù)青等研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)多炔類化合物對(duì)美洲大蠊(Periplaneta americana)離體AChE活性抑制有抑制作用(萬(wàn)樹(shù)青,2005),AChE 是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)。Na+-K+-ATPase對(duì)胞內(nèi)外的Na+、K+具有主動(dòng)運(yùn)輸?shù)墓δ?,是擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)位點(diǎn)之一,當(dāng)Na+-K+-ATPase活性被抑制,昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能出現(xiàn)紊亂,最終使昆蟲(chóng)致死。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,香茅油對(duì)枸杞蚜蟲(chóng)AChE和Na+-K+-ATPase均表現(xiàn)出了抑制作用,由此可以推斷,香茅油作為一種神經(jīng)毒劑作用于枸杞蚜蟲(chóng),影響昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)正常的信號(hào)傳導(dǎo),最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。本實(shí)驗(yàn)為香茅油的殺蟲(chóng)效果及機(jī)理,為香茅油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

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    作者簡(jiǎn)介: 陳新華(1989-),女,內(nèi)蒙古赤峰人,研究方向:農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治。endprint

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