黃連中鹽酸小檗堿的提取純化及抑菌活性研究

屈歡 黃雪 王軍節(jié)

摘要 為了探究鹽酸小檗堿在植物病原真菌方面的抑制作用，以黃連根粉為材料，采用酸水法提取和乙醇重結(jié)晶獲得鹽酸小檗堿純品，采用生長速率法研究了鹽酸小檗堿對(duì)常見植物病原菌的抑制活性。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的提取率為3.3%，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)得其含量為93.56%;抑菌活性試驗(yàn)表明，鹽酸小檗堿在100 μg/mL時(shí)對(duì)玉米大斑病菌的抑制率達(dá)99.9%，EC50為8.20 μg/mL，表現(xiàn)出比藥劑對(duì)照噁霉靈和百菌清更高的抑制活性;進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，與噁霉靈及百菌清相比，鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期長的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 鹽酸小檗堿; 提取純化; 含量測(cè)定; 抑菌活性

中圖分類號(hào)： S 482.292 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019020

Abstract The aim of this study is to measure the antifungal activity of berberine hydrochloride. The root powder of Rhizoma Coptidis was used as material to obtain berberine hydrochloride， the purified product of which was successfully obtained through extraction by using acid-water method and recrystallization with ethanol， and the antifungal activity of berberine hydrochloride against phytopathogenic fungi was investigated using the mycelial growth rate method. The results showed that the extraction rate of berberine hydrochloride was 3.3% and its content was 93.56% measured by HPLC. The results of biological assay indicated that berberine hydrochloride exhibited an excellent antifungal activity against Exserohilum turcicum at the concentration of 100 μg/mL with an inhibition rate of 99.9% and EC50 value of 8.20 μg/mL， which were better than those of hymexazol and chlorothalonil， two commercially available agricultural fungicides. Compared with hymexazol and chlorothalonil， the inhibition effect of berberine hydrochloride on E.turcicum had a longer effective period.

Key words berberine hydrochloride; extraction and purification; determination of content; antifungal activity

由真菌和細(xì)菌引起的植物病害嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，是造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一[1-2]。噴施化學(xué)抑菌劑是目前控制病害采取的主要手段，但存在食品安全、環(huán)境污染以及易誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗性等問題。因此，開發(fā)新型、安全、環(huán)保的農(nóng)業(yè)病害防控技術(shù)是當(dāng)前生產(chǎn)中亟待解決的問題[3]。已有研究證實(shí)植物多種次生代謝產(chǎn)物對(duì)病害具有良好的抑制作用[4-5]，通過植物獲取抑菌成分用于預(yù)防和控制農(nóng)業(yè)病害的發(fā)生，具有低毒、安全、環(huán)境友好等特點(diǎn)，已逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中防治病害的一項(xiàng)新型措施[6-7]。

小檗堿又稱黃連素，一種常見的異喹啉生物堿，主要以鹽酸鹽的形式廣泛分布于植物中，尤其在毛茛科、蕓香科、小檗科植物根莖中含量較高，如在黃連中含量最高可達(dá)10%，是一種理想的天然藥物資源，近年來關(guān)于它的生物學(xué)及藥理學(xué)十分廣泛[8]。文獻(xiàn)報(bào)道及臨床研究表明，小檗堿具有廣譜的抗菌活性，它作為傳統(tǒng)中藥主要用于菌痢、胃腸炎、癰腫等細(xì)菌性感染疾病[9]，而在抑制病原真菌方面的研究和應(yīng)用較少，尤其是植物病原菌防治方面。基于此，本研究選用黃連為原料，從中提取分離得到小檗堿，利用液相色譜分析其含量，采用生長速率法測(cè)試了其對(duì)常見植物病原真菌的抑制活性，探討鹽酸小檗堿對(duì)農(nóng)業(yè)病原菌的抑制作用，為基于天然產(chǎn)物的植物源抑菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃連塊根：購自寧夏銀川國有永吉藥店，將塊根粉碎成粉末狀，過80 目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

供試菌株：玉米大斑病菌Setosphaeria turcica，枸杞根腐病菌Fusarium solani，馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani，馬鈴薯干腐病菌Fusarium sulphureum，小麥赤霉病菌Fusarium graminearum，蘋果腐爛病菌Valsa mali，番茄灰霉病菌Botrytis cinerea，西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum。供試菌株中枸杞根腐病菌和西瓜枯萎病菌為寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定，其余病菌為西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2 儀器及試劑

儀器：1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;X-4熔點(diǎn)測(cè)定儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;ZF-2型三用紫外分析儀，上海市安亭電子儀器廠;HPS-250生化培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司。

試劑：鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，上海瑞永生物科技有限公司;噁霉靈及百菌清，純度≥98%，上海一研生物科技有限公司;薄層層析硅膠，青島市基億達(dá)硅膠試劑廠;色譜純甲醇，阿拉丁;色譜純乙腈，阿拉丁;其他試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃連根中小檗堿的提取、分離與純化及含量測(cè)定1.3.1.1 小檗堿的提取、分離與純化

準(zhǔn)確稱取黃連根粉50 g，加入8倍量的0.5%硫酸水溶液，浸泡24 h，過濾，濾液用石灰乳調(diào)pH為10，靜置30 min后抽濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH為 3，再加入濾液量的10%固體氯化鈉，攪拌至溶液出現(xiàn)微濁現(xiàn)象為止，放置過夜。抽濾，濾餅用蒸餾水洗3次，50℃烘干得鹽酸小檗堿粗品[10]。粗品用熱乙醇重結(jié)晶即得精制的鹽酸小檗堿，使用熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定其熔點(diǎn)，并采用鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，硅膠薄層層析檢測(cè)鹽酸小檗堿的純度。

1.3.1.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定[11]

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（35：65）;檢測(cè)波長345 nm;柱溫為室溫;流速1 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于10 mL容量瓶中溶解，超聲處理30 min，再取1 mL溶于10 mL甲醇即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液備用，即得0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

樣品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿樣品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，然后取1 mL轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶中，加10 mL甲醇溶解并制成0.03 mg/mL的樣品溶液。然后用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 抑菌活性測(cè)定

采用生長速率法[12]測(cè)試目標(biāo)化合物鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌、枸杞根腐病菌、馬鈴薯早疫病菌、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、蘋果腐爛病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌8種病原菌的抑制活性。

將鹽酸小檗堿用少量丙酮溶解，加入PDA 培養(yǎng)基中，制成含藥平板。以加入丙酮溶劑為空白對(duì)照組，以噁霉靈和百菌清作為藥劑對(duì)照。將供試病原菌菌餅（直徑0.4 cm）分別接種于含藥平板上，于 （28±0.5）℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～9 d，觀察菌絲生長情況，并用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

抑菌率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）對(duì)照組菌落直徑-0.4×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿的提取、分離與純化

2.1.1 鹽酸小檗堿的產(chǎn)率與純度

試驗(yàn)用酸水法提取鹽酸小檗堿，并采用乙醇重結(jié)晶方法純化，重復(fù)3次，提取率為3.3%，試驗(yàn)重現(xiàn)性好。經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定其熔點(diǎn)為200℃。以鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，利用硅膠薄層層析法點(diǎn)樣，氯仿∶氨∶甲醇=30∶1∶8展開，于三用紫外分析儀下觀察，目標(biāo)化合物鹽酸小檗堿與標(biāo)準(zhǔn)品在Rf值為0.62的位置上有相同的綠色熒光斑點(diǎn)，初步判斷其為鹽酸小檗堿，且純度較高（圖1）。

2.1.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC的圖譜如圖2所示，從圖中我們可以看出鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品在1.3.1.2條件下各組分分離良好，在保留時(shí)間為3 min時(shí)出現(xiàn)目標(biāo)化合物鹽酸小檗堿的色譜峰，峰面積為94.59%。相同條件下，供試樣品在3 min時(shí)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的色譜峰，峰面積為93.56%，說明從黃連中提取分離純化的為目標(biāo)產(chǎn)物鹽酸小檗堿，且純度較高。

2.2 鹽酸小檗堿的生物活性

2.2.1 鹽酸小檗堿對(duì)常見病原真菌的抑制活性

采用菌絲生長速率法測(cè)定100 μg/mL鹽酸小檗堿及陽性對(duì)照100 μg/mL噁霉靈和100 μg/mL百菌清對(duì)8種植物病原真菌的抑制作用，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在濃度為100 μg/mL時(shí)，鹽酸小檗堿對(duì)馬鈴薯早疫病菌、番茄灰霉病菌、枸杞根腐病菌、蘋果腐爛病菌、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌均都表現(xiàn)出較低的抑制活性，抑制率為7.2%～44.0%，但對(duì)玉米大斑病菌的抑制率為99.9%，表現(xiàn)出比陽性對(duì)照噁霉靈（82.8%）和百菌清（48.0%）更高的抑制活性。在所有供試病菌中，鹽酸小檗堿只表現(xiàn)出對(duì)玉米大斑病菌高的抑制活性，這表明鹽酸小檗堿在農(nóng)作物病原菌抑制方面有可能是一種較專一性的抑菌劑，但本試驗(yàn)的供試菌種數(shù)量有限，對(duì)其他病原菌的作用有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌抑制活性的持效性

在2.2.1的基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀察并記錄鹽酸小檗堿及陽性對(duì)照噁霉靈和百菌清對(duì)玉米大斑病菌的抑制情況，每隔24 h觀察記錄1次，持續(xù)到第9天，其抑菌率如表2所示、抑菌效果如圖3所示。結(jié)果顯示，第4天和第9天，鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌的抑制率都均為99.9%，而噁霉靈的抑制率從82.8%下降為56.1%，百菌清的抑制率從48.0%下降為27.1%，由此可知，與噁霉靈及百菌清相比，鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌的抑制作用隨著時(shí)間的延長，抑制效果可維持不變，在離體培養(yǎng)下具有持效期長的特點(diǎn)。

2.2.3 化合物對(duì)玉米大斑病菌的EC50測(cè)定

按照1.3.2抑菌活性測(cè)試方法，測(cè)定了化合物鹽酸小檗堿、噁霉靈和百菌清梯度濃度下對(duì)玉米大斑病菌的抑制活性，并根據(jù)抑菌結(jié)果計(jì)算EC50，結(jié)果如表3所示。

化合物鹽酸小檗堿表現(xiàn)出對(duì)玉米大斑病菌較高的抑制活性，抑制率為99.9%（表1），以噁霉靈和百菌清原藥為陽性對(duì)照，進(jìn)一步研究了鹽酸小檗堿在梯度濃度下對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果，以濃度的對(duì)數(shù)作為x軸，以抑制率的幾率值作為y軸，利用軟件SPSS 22.0求取毒力回歸方程并計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50，結(jié)果如表3所示。由表中可以看出，鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌的EC50為8.20 μg/mL，遠(yuǎn)低于噁霉靈和百菌清對(duì)該菌的EC50值（噁霉靈和百菌清對(duì)玉米大斑病菌的EC50分別為11.92 μg/mL和13.52 μg/mL），表現(xiàn)出較好的抑制活性。

3 結(jié)論

以黃連根粉為原料提取純化獲得鹽酸小檗堿純品，提取率為3.3%;以鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，利用高效液相色譜法測(cè)定其含量為93.56%;采用菌絲生長速率法對(duì)鹽酸小檗堿的抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在所有供試病菌中，鹽酸小檗堿在100 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出較專一的對(duì)玉米大斑病菌高的抑制活性，抑制率為99.9%，EC50為8.20 μg/mL，抑制活性高于陽性對(duì)照噁霉靈和百菌清;化合物對(duì)玉米大斑病菌持續(xù)抑制情況觀察表明，與噁霉靈及百菌清相比，鹽酸小檗堿對(duì)玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期長的特點(diǎn)。鹽酸小檗堿作為一種在植物中含量較高的天然藥物資源，在抑菌方面表現(xiàn)出的這種專一性和較高的抑制活性，有待于我們進(jìn)一步研究，為開發(fā)高效、低毒新型農(nóng)用殺菌劑提供理論參考。

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（責(zé)任編輯： 田 喆）