miR-222-3p靶向SOCS5促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

薄曉莉 哈麗亞·哈力木別克 潘 靜 張清華 付曉雯 王建軍

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生率和病死率常年居高不下[1，2]。盡管早期宮頸癌的篩查和治療有助于挽救60%～90%患者的生命，但多數(shù)患者仍在晚期發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其預(yù)后較差[3]。因此，闡明宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，有助于制定更好的治療策略。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一類存在于生物體的非編碼RNA分子，其長(zhǎng)度約21～25個(gè)核苷酸[4]。miRNAs通過(guò)結(jié)合mRNAs的3′端非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，進(jìn)而在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。近期的一項(xiàng)研究顯示，miR-222在宮頸癌中顯著高表達(dá)[6]。miR-222是一種前體微小RNA，其成熟體miR-222-3p是在miR-222的3′端臂加工而來(lái)。然而，miR-222-3p在宮頸癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在明確miR-222-3p在宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的具體作用。

材料與方法

1.研究對(duì)象：5例宮頸癌患者來(lái)自于筆者醫(yī)院婦產(chǎn)科，5例健康人來(lái)自筆者醫(yī)院體檢中心，其年齡、體重等指標(biāo)均相匹配。受試對(duì)象均被告知本研究的目的，并簽署知情同意書(shū)。涉及的操作遵照筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

2.細(xì)胞系：正常宮頸上皮永生化細(xì)胞系End1/E6E7、宮頸癌細(xì)胞系SiHa、人胚腎細(xì)胞HEK-293T均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，保存于實(shí)驗(yàn)室。

3.試劑與儀器：胎牛血清FBS、DMEM培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，miRNeasy Serum/Plasma試劑盒和miRNeasy Mini試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)，引物、miR-222-3p mimics、SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、載有野生型SOCS5和突變型SOCS5的載體pGL3(中國(guó)生工公司)，Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、小鼠抗GAPDH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶耦合二抗(中國(guó)碧云天公司)，Transwell小室(美國(guó)BD Biosciences公司)，PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，兔抗SOCS5多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光儀和酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：End1/E6E7細(xì)胞和SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，隔天換液，在5% CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：血清微小RNA的提取用miRNeasy Serum/Plasma試劑盒，細(xì)胞微小RNA用miRNeasy Mini試劑盒提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，程序設(shè)定為95℃10min，然后40個(gè)循環(huán)為95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s。U6作為微小RNA內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。Hsa-miR-222-3p：正向引物5′-GGGGAGCTACATCTGGCT-3′，反向引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。U6：正向引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6.細(xì)胞活力測(cè)定：SiHa細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約6000個(gè)，將miR-222-3p mimics(1μl)、Notch1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(1.2μl)，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞培養(yǎng)48h，然后更換培養(yǎng)基，每孔100μl培養(yǎng)基加入10μl CCK-8反應(yīng)液，培養(yǎng)2h后于酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定450nm。

7.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為密度約為2×105個(gè)，過(guò)夜培養(yǎng)后，用移液管尖端進(jìn)行劃痕，用無(wú)菌PBS輕輕洗去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，24h后進(jìn)行拍照。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸，Transwell小室的上室接種約2×105個(gè)細(xì)胞，Transwell小室的下室倒入含血清的培養(yǎng)基。在細(xì)胞孵箱培養(yǎng)24h后，用甲醇固定下室細(xì)胞，并用0.5%結(jié)晶紫染色20min，然后在倒置顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。

9.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行。HEK-293T細(xì)胞接種于96孔板，約6000個(gè)/孔，將載有野生型SOCS5的pGL3(1μl)與miR-222-3p mimics(1μl)、載有突變型SOCS5的pGL3(1μl)與miR-222-3p mimics(1μl)、載有野生型SOCS5的pGL3(1μl)與mimics NC(1μl)、載有突變型SOCS5的pGL3(1μl)與mimics NC(1μl)分別利用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞內(nèi)，48h后用Bio-GloTMLuciferase Assay System檢測(cè)，分析數(shù)值。

10.蛋白免疫印跡：收集SiHa細(xì)胞，用RIPA裂解，BCA法蛋白濃度定量；蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜；PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2h；抗SOCS5和GAPDH一抗在4℃過(guò)夜孵育；TBST洗膜后，用辣根過(guò)氧化物酶耦合的二抗在室溫孵育PVDF膜2h；ChemDocTMXRS+ System儀器檢測(cè)目的條帶，并用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

結(jié) 果

1.miR-222-3p在宮頸癌上調(diào)表達(dá)：分別取健康人血清和宮頸癌患者血清，檢測(cè)miR-222-3p的表達(dá)水平，qRT-PCR的結(jié)果顯示，患者血清的miR-222-3p顯著增多(圖1A，P=0.008)。此外，宮頸癌細(xì)胞系SiHa的miR-222-3p表達(dá)水平也顯著高于正常宮頸上皮永生化細(xì)胞系End1/E6E7(P<0.01,圖1B)。

圖1 miR-222-3p在宮頸癌上調(diào)表達(dá)A.miR-222-3p在宮頸癌患者血清和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)；B.miR-222-3p在正常宮頸上皮永生化細(xì)胞系End1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞系SiHa中的表達(dá)

2.miR-222-3p促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞惡性表型：將miR-222-3p mimics轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，其增殖能力高于轉(zhuǎn)染mimics NC的SiHa細(xì)胞(圖2A)。進(jìn)一步檢測(cè)miR-222-3p mimics對(duì)SiHa細(xì)胞遷移能力的影響,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，miR-222-3p mimics促進(jìn)SiHa細(xì)胞的遷移能力(圖2B)。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-222-3p mimics增加SiHa細(xì)胞向Transwell下室侵襲的能力(圖2C)。

圖2 miR-222-3p促進(jìn)SiHa細(xì)胞惡性生物學(xué)行為A.SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和mimics NC后的細(xì)胞活力變化；B.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-222-3p mimics對(duì)SiHa細(xì)胞遷移能力的影響；C.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-31-5p mimics對(duì)SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響;與mimics NC比較，*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

3.SOCS5是miR-222-3p的直接靶點(diǎn)：通過(guò)TargetScanHuman7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SOCS5是miR-222-3p的潛在靶點(diǎn)，而且其結(jié)合位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中高度保守。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，共轉(zhuǎn)染野生型SOCS5和miR-222-3p mimics的熒光素酶活性顯著減低(圖3A)，表明SOCS5是miR-222-3p的直接靶點(diǎn)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染了miR-31-5p mimics的SiHa細(xì)胞的SOCS5蛋白水平顯著下調(diào)(圖3B)。為了證實(shí)SOCS5在miR-222-3p下游發(fā)揮作用，筆者進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，SOCS5的蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3C)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞活力明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和空質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞活力(圖3C)。與之相一致的是，共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力均低于共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和空質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞(圖3D和圖3E)。

圖3 SOCS5在miR-222-3p下游調(diào)節(jié)SiHa細(xì)胞的生物學(xué)行為A.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SOCS5是miR-222-3p直接靶點(diǎn)；B.轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics后SiHa細(xì)胞SOCS5的蛋白表達(dá)及灰度分析；C.共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)SiHa細(xì)胞活力的影響；D.共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)SiHa細(xì)胞遷移能力的影響；E.共轉(zhuǎn)染miR-222-3p mimics和SOCS5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

討 論

在全球范圍內(nèi)宮頸癌在女性惡性腫瘤中的發(fā)生率和病死率均排在第4位，在婦科相關(guān)惡性腫瘤中的發(fā)生率和病死率排在第2位，僅次于乳腺癌[1]。目前，早期篩查和疫苗的使用是預(yù)防宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展的重要手段[7，8]。盡管化療和手術(shù)對(duì)部分宮頸癌患者有效，但嚴(yán)重的不良反應(yīng)和并發(fā)癥影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后[9，10]。因此，闡明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制，有助于為患者提供更好的治療策略。

屬于非編碼RNA分子的miRNAs盡管不具備編碼蛋白的功能，卻可以通過(guò)調(diào)控mRNAs特定區(qū)域而影響蛋白表達(dá)，從而在細(xì)胞的多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[11]。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs介導(dǎo)的蛋白表達(dá)異常是宮頸癌發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。Lü等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-664在宮頸癌患者顯著低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-664可以抑制c-Kit表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡增加。一項(xiàng)臨床研究顯示，miR-361-3p在宮頸癌樣本中低表達(dá)，而且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[13]。除了下調(diào)表達(dá)，有些miRNAs在宮頸癌呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。Chen等[14]通過(guò)檢測(cè)臨床樣本發(fā)現(xiàn)，miR-1246在宮頸癌患者顯著上調(diào)，而且提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究表明，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的miR-1246下調(diào)可導(dǎo)致血小板反應(yīng)蛋白-2的表達(dá)升高，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡增加并抑制其增殖；小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-1246的下調(diào)有助于抑制瘤體增長(zhǎng)[15]。這些研究提示，miRNAs的差異表達(dá)在宮頸癌中發(fā)揮截然不同的作用。本研究表明，miR-222-3p在宮頸癌高表達(dá)，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，筆者發(fā)現(xiàn)SOCS5在miR-222-3p的下游發(fā)揮作用。

SOCS5是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子SOCS家族成員之一，通過(guò)調(diào)節(jié)JAK-STAT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制SOCS5可促進(jìn)JAK-STAT3信號(hào)通路活化，從而增加胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。在急性T淋巴細(xì)胞性白血病中，沉默SOCS5的表達(dá)誘導(dǎo)JAK-STAT信號(hào)通路激活，促進(jìn)疾病進(jìn)展[18]。然而，SOCS家族成員在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的研究較少。國(guó)外的一項(xiàng)研究顯示，SOCS1在宮頸癌組織中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)[19]。與此結(jié)果相一致，Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1、SOCS3和SOCS5在宮頸癌組織和細(xì)胞系均呈現(xiàn)表達(dá)減少。但SOCS5在宮頸癌中的功能學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SOCS5可抑制miR-222-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促增殖、促遷移和促侵襲作用。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-222-3p具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，而且其作用與抑制SOCS5表達(dá)有關(guān)。因此，這些結(jié)果初步提示miR-222-3p在宮頸癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。