異搏定通過抑制TXNIP介導(dǎo)的細胞凋亡和炎癥減輕高脂喂養(yǎng)小鼠的糖尿病前期神經(jīng)病變

葉 婷 阿克拜爾·烏普 岳薇薇 馬 麗

糖尿病是一種由于胰島素分泌異常而引起高血糖的代謝性疾病，是并發(fā)癥最多的一種疾病，主要癥狀為多飲、多食、多尿、體重下降，長期高血糖會導(dǎo)致嚴重的心臟、腦、腎臟、眼以及神經(jīng)系統(tǒng)的病變[1]。糖尿病患者中約有10%在初次診斷時就已經(jīng)伴有神經(jīng)損傷，包括觸覺、溫覺、痛覺等損傷[2]。并且已有研究表明糖尿病前期也會出現(xiàn)神經(jīng)病變[3]。但是臨床上并沒有有效的方式來治療糖尿病前期神經(jīng)病變，因此尋找有效的糖尿病前期神經(jīng)病變治療藥物對于糖尿病的治療至關(guān)重要。異搏定又稱維拉帕米是用于治療心血管疾病的有效藥物，目前已有臨床研究表明異搏定能夠增強胰島素的分泌，或可用于糖尿病的治療[4]。但其對糖尿病前期神經(jīng)病變的影響及機制尚未報道。本研究探究了異搏定對高脂喂養(yǎng)小鼠的糖尿病前期神經(jīng)病變的影響，旨在為糖尿病前期神經(jīng)病變治療提供幫助。

材料與方法

1.材料：C57BL/6小鼠，高脂飼料(卡文斯實驗動物有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(索萊寶生物科技有限公司)；維拉帕米片(廣東華南藥業(yè)集團有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6檢測試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；ACCU-CHEK Advantage血糖儀、血糖試劑條(德國羅氏公司)；TUNEL凋亡試劑盒(美國Solarbio公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR檢測試劑盒(愛必夢生物技術(shù)有限公司)；GAPDH、TXNIP、NLRP3抗體、山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

2.糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠造模及給藥：4周齡C57BL/6小鼠分為對照組、模型組和異搏定組，對照組給予正常飲食，模型組和異搏定組小鼠給予高脂飲食，每兩周尾靜脈采血，利用血糖儀檢測血糖變化；與對照組比較，模型組和異搏定組小鼠首次出現(xiàn)顯著高血糖時檢測模型組小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，選定神經(jīng)傳播速度顯著降低的小鼠作為糖尿病前期神經(jīng)病變模型。對照組選用10只健康的C57BL/6，模型組和異搏定組各選10只糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠，異搏定組小鼠灌胃給予異搏定，劑量為0.5g/kg，2次/天，對照組和模型組小鼠給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，給藥30天，每5天檢測各組小鼠血糖水平。

3.坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測定：給藥結(jié)束后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，使用生理記錄儀檢測坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)，在右側(cè)坐骨切跡插入刺激電極，在踝部(遠端)和左足底第2趾間分別插入記錄電極，記錄雙通道復(fù)合動作電位，以兩對記錄電極間距離S(mm)除以兩通道復(fù)合動作電位潛伏期之差△t(ms)來計算 MNCV。每間隔1min，重復(fù)電刺激 3 次，取其平均值，計算MNCV。

4.HE染色檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)病理變化：給藥結(jié)束后，解剖小鼠取坐骨神經(jīng)組織，于組織固定液中固定24h，固定后將組織用梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋后制成組織切片，然后將石蠟切片進行透明水化，經(jīng)過蘇木精-伊紅染色、封片后于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化。

5.Elisa檢測各組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平：給藥結(jié)束后，各組小鼠眼眶取血，室溫靜置1h后，3500r/min，4℃離心15min，取上層血清，按照Elisa試劑盒方法檢測血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，主要步驟為鋪好一抗的96孔板內(nèi)加入40μl待測樣品和10μl生物素標記抗體后，再加入100μl辣根過氧化物酶標記抗體，37℃孵育75min，清洗96孔板后加入顯色劑顯色，終止后于450nm波長處測吸光度，根據(jù)標準曲線計算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

6.原位缺口末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡：給藥結(jié)束后，解剖小鼠取坐骨神經(jīng)組織，于組織固定液中固定24h后制備石蠟切片，將制備好的石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯及各梯度乙醇脫蠟至水，然后蒸餾水水化5min后，用0.1mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中進行熱修復(fù)，分別經(jīng)過3%H2O2甲醇液、0.1%TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反應(yīng)混合液、POD 轉(zhuǎn)化劑孵育及PBS沖洗后，DAB 溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS 沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并計算坐骨神經(jīng)凋亡細胞數(shù)目。

7.RT-qPCR檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達：給藥結(jié)束后，取各組小鼠坐骨神經(jīng)組織，立刻置于液氮中保存。取液氮保存小鼠坐骨神經(jīng)組織加入Trizol研磨至組織完全裂解，取研磨液加入200μl氯仿，靜置5min后，于12000×g，4℃離心15min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入500μl異丙醇，12000×g，4℃離心10min，去上清，1ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20μl RNA-free水重懸RNA沉淀，55℃水浴10min，即為總RNA。使用primer premier5.0軟件設(shè)計TNF-α、IL-1β、IL-6引物，按照cDNA合成試劑盒和RT-qPCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR，采用ΔΔCT法計算TNF-α、IL-1β、IL-6表達量。

8.Western blot法檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)組織TXNIP和 NLRP3表達水平：取各組小鼠坐骨神經(jīng)組織，加入Trizol研磨均勻，然后加入1.5ml的異丙醇，12000×g，4℃離心10min，去上清，用蛋白清洗液清洗3次后，用1%的SDS溶液重懸沉淀，即為總蛋白。BCA蛋白定量后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2h，然后以稀釋后的GAPDH、TXNIP、NLRP3一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)0.5min，曝光并拍照，用Image J軟件曝光結(jié)果進行定量分析。

結(jié) 果

1.給藥期間各組小鼠血糖變化：模型組小鼠血糖水平顯著高于對照組小鼠血糖水平(P<0.05)，異搏定組小鼠血糖水平顯著低于模型組小鼠血糖水平(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 給藥期間各組小鼠血糖變化與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響：給藥后各組小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測結(jié)果詳見表1，與對照組比較，模型組小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著下降(P<0.05)；而異搏定組小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著高于模型組(P<0.05)。

表1 給藥后各組小鼠MNCV檢測結(jié)果

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠坐骨神經(jīng)組織病理變化影響：根據(jù)HE染色結(jié)果，對照組小鼠坐骨神經(jīng)纖維排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整，纖維形狀規(guī)則，髓鞘顏色均勻，沒有病理變化；模型組小鼠坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)紊亂，纖維細胞排列不均勻，髓鞘顯著變薄且分布不均勻，軸索變細甚至收縮，病理變化顯著；異搏定組小鼠坐骨神經(jīng)組織病變顯著緩解，纖維細胞排列較整齊，組織結(jié)構(gòu)損傷顯著緩解，髓鞘顏色均勻(圖2)。

圖2 各組小鼠坐骨神經(jīng)組織HE染色結(jié)果(×200)

4.異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠血清炎性因子的影響：Elisa檢測各組小鼠血清炎性因子結(jié)果顯示，模型組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6顯著高于對照組(P<0.05)；而與模型組比較，異搏定組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6顯著下降(P<0.05，表2)。

表2 給藥后各組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

5.異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡的影響：TUNEL法檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)組織細胞凋亡結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，異搏定組小鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡顯著緩解(P<0.05，表3)。

表3 給藥后各組小鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡率比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

6.異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠坐骨神經(jīng)組織炎性因子表達影響：RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠坐骨神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，異搏定組小鼠坐骨神經(jīng)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著下調(diào)(P<0.05，表4)。

表4 給藥后各組小鼠坐骨神經(jīng)組織炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

7.異搏定對各組小鼠坐骨神經(jīng)組織TXNIP、NLRP3表達影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠坐骨神經(jīng)TXNIP、NLRP3表達量顯著上升(P<0.05)，而異搏定組小鼠坐骨神經(jīng)組織TXNIP、NLRP3表達量顯著降低(P<0.05，圖3，表5)。

圖3 各組小鼠坐骨神經(jīng)組織TXNIP、NLRP3表達結(jié)果

表5 各組小鼠坐骨神經(jīng)組織TXNIP、NLRP3表達水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的代謝性疾病，并且長期高血糖會引發(fā)多種糖尿病并發(fā)癥，導(dǎo)致多器官衰竭及糖尿病晚期神經(jīng)系統(tǒng)嚴重病變，發(fā)生率可達85%，主要臨床表現(xiàn)為肢端麻木、感覺異常、痛覺過敏、觸覺異常、腱反射減弱或消失等[5，6]。目前臨床上的治療方法主要為控制血糖、陣痛治療以及提供神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)等，但治療效果并不顯著。近年來，逐漸有研究表明，糖尿病在發(fā)病初期就已經(jīng)伴隨著神經(jīng)病變[7]。若在糖尿病發(fā)病初期就能采取治療，抑制神經(jīng)病變的發(fā)展，對于糖尿病并發(fā)癥的治療至關(guān)重要。異搏定是一種用于心血管疾病治療的藥物，但是逐漸有研究報道異搏定可用于糖尿病的預(yù)防和治療[8]。然而異搏定對糖尿病前期神經(jīng)病變的影響尚無明確報道，本研究通過構(gòu)建糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠模型，發(fā)現(xiàn)異搏定能夠顯著緩解糖尿病小鼠高血糖以及坐骨神經(jīng)損傷。

炎性反應(yīng)與糖尿病密切相關(guān)[9]?！疤悄虿⊙装Y學(xué)說”認為，糖尿病患者中的胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是由組織炎癥所引起的[10]。并且大部分糖尿病患者均伴有體內(nèi)嚴重的炎性反應(yīng)[11]。有研究指出控制體內(nèi)炎癥可緩解糖尿病的進程，并且炎性反應(yīng)也會引起神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞，神經(jīng)組織炎性因子浸潤會引起劇烈疼痛，盡管糖尿病前期神經(jīng)病變不嚴重，但經(jīng)過長期的積累會造成嚴重的神經(jīng)組織病變，從而加重糖尿病并發(fā)癥[12，13]。所以在糖尿病前期治療過程中，神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的控制也是至關(guān)重要的。本研究發(fā)現(xiàn)，異搏定能夠顯著減低糖尿病小鼠血清中的炎性因子以及坐骨神經(jīng)組織中炎性因子的表達，說明異搏定能夠通過抑制炎性反應(yīng)來控制糖尿病以及糖尿病前期神經(jīng)病變。

神經(jīng)細胞凋亡是糖尿病前期神經(jīng)病變的主要病理特征之一，神經(jīng)細胞凋亡是引起神經(jīng)系統(tǒng)病變的主要因素[14]。細胞凋亡受多種基因共同調(diào)控，在糖尿病發(fā)病過程中，各器官組織均高表達TXNIP[15]。并有研究表明，高血糖和高游離脂肪酸均能夠引起TXNIP的高表達。TXNIP在病理刺激下會與NLRP3炎性小體結(jié)合促進IL-1β分泌增多，加重炎性反應(yīng)，進而導(dǎo)致細胞凋亡增加[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠坐骨神經(jīng)組織中TXNIP和NLRP3表達量顯著上調(diào)，并且坐骨神經(jīng)組織中細胞凋亡率顯著上升，說明糖尿病前期神經(jīng)病變與神經(jīng)組織炎癥和細胞凋亡密切相關(guān)，而異搏定給藥后小鼠坐骨神經(jīng)組織中TXNIP和NLRP3表達量顯著下調(diào)，且凋亡率顯著下降，說明異搏定能夠通過抑制神經(jīng)組織TXNIP的表達而緩解糖尿病前期神經(jīng)病變。

綜上所述，異搏定能夠顯著緩解糖尿病小鼠前期神經(jīng)病變，其機制可能是通過抑制TXNIP的表達而減輕炎癥和細胞凋亡。