黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝研究

張潔茹，葉淑紅，羅明洋，張 彧*，羅連富

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095；3.大連富森智能科技有限公司，遼寧大連 116034）

黑木耳（Auricularia auricular）是一種營養(yǎng)豐富的食用菌，已有眾多研究表明其富含粗蛋白、粗多糖、腺苷類物質(zhì)、膳食纖維、黃酮、維生素K、纖維素和多種人體必備礦物質(zhì)元素等[1-2]。同時黑木耳有多種生物學活性以及很高的藥理價值，有清除自由基、群體感應等功能，對預防和減緩高血壓、高血脂也有積極作用[3-4]。白刺果（Nitraria tangutorum）是在中國干旱地區(qū)廣泛種植的一種灌木植物，有“沙漠櫻桃”之稱。果實中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全[5]。維生素、有機酸和鈣、鐵、鋅等微量元素也十分充足，含有安全無毒的天然紅色素，有較高的應用價值[6]。

近年來，發(fā)酵飲料行業(yè)受到越來越多關注，由于擁有特定的營養(yǎng)功效和口感，發(fā)酵技術已被應用到很多軟飲料中[7]。其中，乳酸菌應用極其廣泛。乳酸菌的發(fā)酵可以減緩果（Lactobacillus plantarum）蔬中酚類物質(zhì)的分解，提高抗氧化的能力[8-9]。植物乳桿菌作為最常見的乳酸菌之一，常用于發(fā)酵食品中，具有多種益生作用，如改善胃腸道功能、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強生物屏障、降膽固醇及吸附重金屬等[10]。與乳制品為原料相比，以食用菌和水果為原料進行發(fā)酵是乳酸菌發(fā)酵未來的發(fā)展趨勢[11]。

本實驗選取黑木耳和白刺果為原料，經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵，制備黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料，并采用單因素及響應面試驗優(yōu)化乳酸發(fā)酵工藝，確定發(fā)酵工藝參數(shù)。不僅讓我國豐富的木耳資源得到充分利用，還添加白刺果來改善產(chǎn)品顏色，調(diào)節(jié)產(chǎn)品風味，使復合乳酸飲料克服了單一木耳發(fā)酵在感官品質(zhì)上的不足。且乳酸發(fā)酵賦予了飲料獨特的口感，既可以滿足消費者口味的差異化，也滿足生物技術的發(fā)展趨勢，為乳酸菌飲料的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；白刺果：都蘭海枝紅生物科技有限責任公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實驗室保藏；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硼酸（分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

722S 可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ZHWY-211B 恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理機：九陽股份有限公司；SHP-150 生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；SX-500壓力蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；JJ-2 組織搗碎勻漿機：江蘇杰瑞爾電器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；WYA-2W雙目數(shù)字阿貝折射儀：上海精科儀電物光儀器有限公司；QN-30壓蓋機：湖南省科特包裝檢測技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料加工工藝流程

1.3.2 操作要點

挑選、水洗、浸泡：選擇干凈無雜質(zhì)、無霉變的優(yōu)質(zhì)黑木耳，粒大、飽滿、無雜質(zhì)的白刺果，取適量的水洗滌干凈，木耳放入足量的水中浸泡50～60 min，待其完全泡發(fā)膨脹，備用。

打漿、過濾：黑木耳和白刺果質(zhì)量比為5∶1，按所需用量稱取泡發(fā)后的黑木耳和白刺果。此時原料打漿后還原糖含量為8.21 mg/mL，可以為植物乳桿菌發(fā)酵提供充分的碳源[12]。原料與水按1∶8（g∶mL）的固液比加水，打漿。打漿后的混合原漿，用四層紗布過濾獲得濾液。

殺菌：混合漿液在65 ℃下殺菌30 min。

乳酸菌發(fā)酵：混合漿液的植物乳桿菌接種量為2%（V/V），在37 ℃的恒溫搖床中進行發(fā)酵，待63 h后發(fā)酵結束。

均質(zhì)、離心：發(fā)酵原液在8 000 r/min條件下均質(zhì)5 min。再放入離心機10 000 r/min條件下離心15 min。

風味調(diào)配、灌裝：澄清發(fā)酵液中加入14%的蔗糖，待完全溶解后裝入容器中，用壓蓋機封口。

殺菌、冷卻：灌裝后的發(fā)酵液在65 ℃下殺菌30 min，取出冷卻至常溫，即可得到黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料。

1.3.3 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

飲料于37 ℃、120 r/min下發(fā)酵，分別考察植物乳桿菌接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（V/V））、原料和水的比例（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g∶mL））、發(fā)酵時間（40 h、48 h、56 h、64 h、72 h）、裝液量（30%、40%、50%、60%、70%），對還原糖利用率和感官評分的影響。

1.3.4 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選擇固液比（A）、發(fā)酵時間（B）、裝液量（C）為影響因素，以感官評分（Y）為響應值，采用Box-Bohnken試驗設計3因素3水平試驗，確定最佳工藝參數(shù)。Box-Bohnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 測定方法

還原糖含量測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[13]（還原糖利用率=（發(fā)酵前原液中還原糖量-發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖量）/發(fā)酵前原液中還原糖量×100%）；可溶性固形物測定：采用折光計法[14]；總酸含量測定：采用酸堿滴定法[15]；γ-氨基丁酸含量測定：采用比色法[16]。

微生物指標測定：按照國標GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》、GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》、GB 29921—2013《食品中致病菌限量》進行測定[17-19]。

1.3.6 感官評分方法

感官評定參照QB/T 5323—2018《植物酵素》中規(guī)定的評價標準[20]，滿分10分。具體評分標準見表2。

表2 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of compound lactic acid bacteria beverage of Auricularia auricular and Nitraria tangutorum

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin、Design ExpertV8.0.6等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 接種量的影響

圖1 不同接種量對還原糖利用率和感官評分的影響Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖1可知，接種量＜2.0%之前，植物乳桿菌產(chǎn)少量的黏性物質(zhì)，對產(chǎn)品的風味產(chǎn)生不利影響，且復合發(fā)酵液中乳酸發(fā)酵不徹底，導致乳酸轉(zhuǎn)化率較低；接種量在2.0%時，還原糖利用率達到27.7%，其感官評分也最高，為7.0分；接種量在2.5%時，菌體之間競爭能力強，消耗營養(yǎng)也更多，用于生成乳酸的底物較少，不利于乳酸形成，還原糖利用率大幅下降；接種量在3.0%時，部分乳酸菌種在競爭中占據(jù)優(yōu)勢，使得還原糖的利用率再次上升，但發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)充分利用后產(chǎn)酸不再增加[21]。因此，植物乳桿菌最佳接種量為2.0%。

2.1.2 固液比的影響

圖2 不同固液比對還原糖利用率和感官評分的影響Fig.2 Effects of different solid-liquid ratio on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖2可知，固液比在1∶6（g∶mL）與1∶7（g∶mL）時，加入到原料中的水量過少，導致原料在植物乳桿菌發(fā)酵時還原糖的浸出不完全，還原糖利用不足。發(fā)酵液較濃稠，流動性較差，口感欠佳；當固液比為1∶8（g∶mL）時，植物乳桿菌對還原糖的利用率及感官評分最高，分別為39.5%、7.2分。而固液比在1∶9（g∶mL）和1∶10（g∶mL）時，由于加入的水量過多，對原液的稀釋倍數(shù)過大，最終的發(fā)酵液較稀，味道寡淡，風味欠缺。因此，最佳固液比為1∶8（g∶mL）。

2.1.3 發(fā)酵時間的影響

圖3 不同發(fā)酵時間對還原糖利用率和感官評分的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

發(fā)酵時間是影響發(fā)酵原液產(chǎn)品風味的關鍵所在。因為乳酸菌有產(chǎn)酸的作用，若時間過短，發(fā)酵原液中酸少醇多，口感欠佳；若發(fā)酵時間過長，發(fā)酵原液中酸多醇少，同樣影響品質(zhì)[26]。

由圖3可知，當發(fā)酵時間＜64 h之前，還原糖利用率和感官評分呈現(xiàn)明顯上升趨勢。發(fā)酵至40 h，還原糖的利用率僅有8.2%，感官評分為5.7分；發(fā)酵48 h時，還原糖利用率上升至17.5%，感官評分為6.5分；發(fā)酵56 h時，還原糖利用率為35.0%，感官評分7.4分。當發(fā)酵至64 h時，還原糖的利用率達43.9%，感官評分最高，為8.0分；發(fā)酵時間＞64 h之后，還原糖利用率上升趨勢平緩，發(fā)酵從64 h到72 h，還原糖利用率僅上升1.8%。因為物料中營養(yǎng)有限，發(fā)酵已接近尾聲。但其感官評分下降至7.5分。因此，最適發(fā)酵時間為64 h。

2.1.4 裝液量的影響

植物乳桿菌是異養(yǎng)厭氧型微生物，當瓶內(nèi)氧氣耗盡后開始無氧呼吸[22]。

圖4 不同裝液量對還原糖利用率和感官評分的影響Fig.4 Effect of different liquid-loading volume on reducing sugar utilization rate and sensory evaluation

由圖4可知，裝液量＜60%之前，還原糖利用率不斷升高，感官評分也隨之增加。裝液量由40%升高到50%的過程中，其還原糖利用率變化最大，由31.5%迅速提高到50.01%。感官評分在此時間內(nèi)也由6.4分提升到7.5分；裝液量為60%時，還原糖利用率最高，達50.88%。同時產(chǎn)品感官評分也最高，為8.5分，此時酸度易被接受，口感清爽；裝液量＞60%之后，還原糖利用率及感官評分均呈現(xiàn)下降趨勢。因此，最適裝液量為60%。

2.2 黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面模型的建立及顯著性檢驗

采用Box-Bohnken中心組合試驗設計，考察各因素對還原糖利用率和感官評分的影響，借助Design ExpertV8.0.6軟件進行分析。根據(jù)單因素試驗結果，固定接種量為2%（V/V），選取對還原糖利用率和感官評分影響較大的3個因素：固液比（A）、發(fā)酵時間（B）、裝液量（C），以感官分數(shù)為（Y）為響應值，采用Box-Bohnken試驗設計，試驗方案及結果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸方程顯著性檢驗與方差分析Table 4 Significance test and variance analysis of regression equation

通過Design ExpertV8.0.6軟件對表3試驗結果進行二次回歸分析，獲得固液比（A）、發(fā)酵時間（B）、裝液量（C）對黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料感官評分（Y）的回歸方程：

由表4可知，回歸方程模型P值為0.000 1＜0.01，極顯著；失擬項P值為0.473 3＞0.05，不顯著；說明建立的回歸方程擬合良好。決定系數(shù)R2=0.991 7，說明99.17%的響應值變化可以用該模型解釋。該試驗模型可用于確定黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料的最佳工藝。對感官評分影響次序依次為發(fā)酵時間＞固液比＞裝液量，其中一次項B、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A、C及交互AB相對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著。

2.2.2 因素交互作用響應面分析

固液比、發(fā)酵時間和裝液量對白刺果復合乳酸菌飲料感官評分影響的響應面及等高線見圖5。

圖5 固液比、裝液量及發(fā)酵時間對復合乳酸菌飲料感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid-liquid ratio,liquid-loading volume and fermentation time on sensory evaluation of compound lactic acid bacteria beverage

由圖5可知，各因素在植物乳桿菌發(fā)酵過程的交互作用，AB交互作用差異顯著，其表現(xiàn)為等高線形狀為橢圓形。AC和BC交互作用不顯著，等高線形狀為圓形。發(fā)酵時間與固液比響應面曲線相對較陡，因此對感官的影響最顯著；而發(fā)酵時間與裝液量、固液比與裝液量曲線較為平緩，響應值變化隨其數(shù)值的變化較小，因此對感官評分影響較小。

2.2.3 驗證試驗

采用Design ExpertV8.0.6軟件對回歸模型進行分析，獲得的最佳發(fā)酵工藝為：固液比1∶8（g∶mL），發(fā)酵時間63 h，裝液量58%。在此優(yōu)化條件下進行3次重復驗證試驗，得到產(chǎn)品的感官評分的實際值為9.1分，與理論預測值9.06分相近。綜上，說明實驗所得模型與實際情況擬合程度良好，能夠較好地反映出固液比、發(fā)酵時間和裝液量與復合發(fā)酵原液感官評分之間的關系，可采用該模型對產(chǎn)品的感官評分進行預測。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量評價

2.3.1 感官指標

產(chǎn)品呈亮紅褐色，酸甜適中，口感柔和細膩，擁有黑木耳白刺果的天然風味和乳酸發(fā)酵的特殊香氣。

2.3.2 理化指標

在最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的黑木耳白刺果復合乳酸菌飲料還原糖含量為3.80 mg/mL，總酸度為2.48 g/100 mL，可溶性固形物含量為4.5%，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL。

2.3.3 微生物指標

細菌總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

3 結論

本研究以食用菌黑木耳為主要原料，搭配白刺果，采用植物乳桿菌發(fā)酵，研究了復合原液的發(fā)酵工藝。通過單因素試驗和中心組合設計試驗，采用響應面分析法優(yōu)化了黑木耳白刺果復合發(fā)酵原液的工藝條件，確定最終的工藝參數(shù)為：木耳、白刺果質(zhì)量比5∶1，固液比1∶8（g∶mL），植物乳桿菌發(fā)酵階段接種量2.0%（V/V），于37 ℃下發(fā)酵時間63 h，裝液量為58%。在此優(yōu)化條件下，復合乳酸菌飲料感官評分為9.1分，還原糖含量為3.80mg/mL，酸度為2.48 g/100 mL，γ-氨基丁酸含量24 μg/mL，顏色為紅褐色，擁有純正乳酸香氣，酸度適宜，口感細膩。結果表明，在本試驗范圍內(nèi)建立的二次回歸模型準確有效，可提高復合發(fā)酵液的品質(zhì)，為開發(fā)新型黑木耳白刺果復合發(fā)酵飲料提供了新的依據(jù)。