UPLC-Q/Orbitrap HRMS測定大曲中5種糖和甘露糖醇

劉 松，趙振宇，趙尚碧，王和玉

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

大曲又稱塊曲或磚曲，以大麥、小麥、豌豆等為原料，經(jīng)過粉碎，加水混捏，壓成曲醅，形似磚塊，大小不等，讓自然界各種微生物在上面生長而制成[1]。大曲是酒之骨，是有益微生物和有效生物酶、香味物質(zhì)和香味物質(zhì)前驅(qū)物質(zhì)的載體，它決定了中國白酒的香型、風(fēng)格和流派[2]。大曲富含糖類物質(zhì)，主要包括淀粉、糊精、低聚糖、二糖、單糖等[1]，目前大曲中糖的研究主要是還原糖和總糖[3]，而具體到單一種類糖的研究鮮有報道，WU X等[4]運用1H核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)檢測了大曲中的葡萄糖、麥芽糖和甘露糖醇等甜味物質(zhì)，石亞林等[5]運用衍生化方法定性并定量了大曲中游離態(tài)的6種糖和6種糖醇，研究了不同白酒大曲中6種糖和6種糖醇的變化規(guī)律。大曲中糖類組成的系統(tǒng)性研究，可在一定程度上為大曲中微生物代謝機制的研究提供新的思路和理論依據(jù)。

目前單、雙糖的檢測方法有化學(xué)法[6]、高效液相色譜法[7-9]、離子色譜法[10-12]和質(zhì)譜法[13-20]?；瘜W(xué)法測定糖類物質(zhì)，檢出限較高，且無法同時測定多種糖類物質(zhì)；高效液相色譜法多采用示差折光檢測器或蒸發(fā)光檢測器等通用型檢測器，存在樣品分析時間較長或重現(xiàn)性不理想等問題；離子色譜法對糖類物質(zhì)分離較好，但受樣品基質(zhì)干擾嚴(yán)重；質(zhì)譜法具有選擇性好，檢出限較低，抗干擾能力強等特點，是糖類物質(zhì)檢測方法發(fā)展趨勢。大曲屬于復(fù)雜的發(fā)酵制品，容易產(chǎn)生難以解析的背景基質(zhì)的干擾，導(dǎo)致測定的不準(zhǔn)確性，本研究基于簡便的樣品制備和超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap HRMS）檢測技術(shù)，以期建立一種能同時快速、準(zhǔn)確測定大曲中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘露糖醇的直接分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：某酒廠提供；乙腈（質(zhì)譜純）：德國默克公司；乙酸銨（質(zhì)譜純）、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；所有實驗用水均為超純水（18.2 MΩ）。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）：美國Thermo Fisher Scientific；IQ7003純水儀：美國MILLIPORE公司；MIKRO 220R離心機：德國Hettich公司；XP205分析天平：瑞士METTLERTOLEDO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中，加入30 mL水，2 000 r/min振蕩提取15 min，10 000 r/min、4 ℃離心5 min后取上清液0.75 mL于2 mL離心管中，加入0.75 mL乙腈后漩渦混勻5 min，10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，取上清液用乙腈稀釋2倍，漩渦混勻后再次高速冷凍離心10 min，取上清液用體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈水溶液稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。此時樣品中目標(biāo)物對于原樣品已稀釋600倍。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUI TY BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫：50 ℃；流動相：A為含有0.1%氨水的乙腈，B為含有0.1%氨水的5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積1.0 μL；線性梯度洗脫，起始流動相為90%的A，10%的B，保持5 min，到12 min流動相A變?yōu)?5%，流動相B變?yōu)?5%，到17 min流動相A變?yōu)?0%，流動相B變?yōu)?0%，保持6 min，到24 min變成起始流動相比例，保持6 min，整個分析流程30 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：離子源采用加熱電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；吹掃氣：35 arb；鞘氣：10 arb；反吹氣：0 arb；電離電壓：-3.0 kV；離子傳輸管溫度：320 ℃；離子源溫度：200 ℃；負(fù)離子模式監(jiān)測，采用full MS-Target MS2掃描方式測定，掃描范圍50～370 m/z，full MS掃描的分辨率為70 000，Target MS2掃描模式分辨率為17500。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖醇分別準(zhǔn)確稱取0.100 g至100.0 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈水溶液溶解并定容至100.0 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

分別精密量取上述6種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，置于10.0 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈水溶液定容，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L、50.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

5種糖類物質(zhì)，葡萄糖和果糖，蔗糖、麥芽糖和乳糖分別是同分異構(gòu)的單糖和雙糖，分子質(zhì)量完全一樣，結(jié)構(gòu)相似，它們的二級特征碎片也有極高的相似度，因此用質(zhì)譜分別檢測5種糖含量的前提是實現(xiàn)它們在液相部分的完全分離[21]。乙腈-乙酸銨流動相體系能較好的將5種糖類物質(zhì)洗脫分離，但峰型較差，在乙腈-乙酸銨流動相溶液中添加0.1%的氨水，峰型有所改善，且甘露糖醇峰形較好，因此本方法中選擇乙腈-乙酸銨流動相溶液中添加0.1%的氨水的流動相體系。同時研究發(fā)現(xiàn)流動相中乙腈起始含量＜75%，果糖與葡萄糖無法分離，而乙腈起始含量＞95%，麥芽糖和乳糖無法分離；不同的流速對5種糖的分離影響結(jié)果顯示，流速＜0.25 mL/min，各化合物峰型較差，流速＞0.25 mL/min時，5種糖的分離效果較差；不同的柱溫對5種糖的分離效果影響顯示，柱溫低于50 ℃，麥芽糖峰寬變大，峰型較差，且與乳糖分離效果較差，柱溫高于50 ℃，麥芽糖與乳糖的峰型和分離效果較好。同時在樣品的前處理中發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)溶劑為體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈水溶液時，葡萄糖與果糖、蔗糖、麥芽糖與乳糖才可以較好的分離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用流動注射的方式對6種化合物進(jìn)樣分析，優(yōu)化離子源電壓、溫度、鞘氣、輔助氣、吹掃氣、脫溶劑溫度等參數(shù)，得到6種化合物的母離子均為分子離子峰[M-H]-，各物質(zhì)的特征離子、碰撞能量見表1。6種化合物配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)入儀器進(jìn)行分析，6種化合物的質(zhì)譜圖見圖1。

表1 6種化合物離子對及碰撞能量Table 1 Ion pairs and collision energy of six kinds of compounds

圖1 6種化合物質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of six kinds of compounds

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

2.3.1 提取方式

糖及糖醇較易溶于水，因此本研究以水為提取溶劑。在提取方式上，常見的提取方法有靜提法、振蕩提取法、超聲輔助提取法，靜提法一般耗時較長，因此本文優(yōu)先選擇振蕩提取法和超聲輔助提取法。準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中，加入30 mL水，對比振蕩提取、超聲輔助振蕩提取兩種提取方式，結(jié)果見圖2。以化合物的峰面積為參照指標(biāo)，由圖2可知，兩種提取方式對葡萄糖、麥芽糖、甘露糖醇的含量測定上無明顯差異，選擇更為環(huán)保的振蕩提取；同時可以得出，在提取時間＞15 min后，各化合物的峰面積趨于穩(wěn)定，所以選擇提取時間為15 min。最終大曲樣品的提取方式為振蕩提取15 min。

圖2 不同提取方式對化合物影響Fig.2 Effect of different extraction methods on compounds

2.3.2 去除蛋白質(zhì)和色素等干擾物

大曲主要原料為小麥，經(jīng)過高溫發(fā)酵后，大曲中含有大量的蛋白質(zhì)類物質(zhì)、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及微生物代謝產(chǎn)物，用水提取后，提取液中含有大量的色素等物質(zhì)。本研究考察了乙腈對沉淀蛋白和色素的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2次乙腈溶液稀釋后高速冷凍離心處理，提取液可達(dá)到澄清透明狀態(tài)，干擾物含量顯著下降，達(dá)到大批量連續(xù)分析對樣品潔凈度的要求，此時樣品的回收率高，且峰形較好，較少內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用體積分?jǐn)?shù)75%乙腈水溶液配制成質(zhì)量濃度范圍為0.10～50.00 mg/L系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別在Q-Exactive儀器上進(jìn)行測定，以峰面積為Y，質(zhì)量濃度為X，得到線性回歸方程；根據(jù)方法檢出限為基線噪音10倍的方法測定方法檢出限，結(jié)果見表2。

表2 6種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations,correlation coefficients and detection limits of 6 compounds

2.5 方法精密度和回收率

在上述實驗條件下，將3個不同添加水平的大曲樣品重復(fù)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。

表3 6種化合物的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of standard recovery rates tests of six kinds of compounds

由表3可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖醇的平均回收率分別為91.5%～102.3%、82.3%～93.3%、87.8%～94.1%、94.7%～108.4%、88.5%～102.4%、84.6%～98.3%，RSD分別為4.1%～5.6%、4.8%～6.2%、5.7%～8.4%、6.1%～9.4%、3.4%～5.4%、3.5%～4.2%，表明該方法精密度較好。

2.6 大曲樣品的測定

選取某白酒生產(chǎn)企業(yè)的不同季節(jié)的大曲樣品10份（A-J），按照1.3節(jié)方法制備樣品待測液，上機檢測，每種樣品取3份平行測試，樣品中5種糖和甘露糖醇的含量見表4。

表4 大曲中5種糖和甘露糖醇的含量Table 4 Contents of five sugars and mannitol in Daqu mg/kg

由表4可知，大曲中主要的還原糖和糖醇是葡萄糖和甘露糖醇，其中葡萄糖占還原性單糖絕大部分，麥芽糖占還原性雙糖的絕大部分，果糖、乳糖和蔗糖含量相對較少，甘露糖醇的含量較為豐富。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時檢測大曲中多種糖和糖醇含量的方法。樣品經(jīng)過振蕩提取，乙腈除去干擾物，高速冷凍離心等方式處理，采用ACQUI TY BEH Amide色譜柱，在負(fù)離子檢測模式下進(jìn)入高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖醇在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，R2均＞0.99，回收率在82.3%～102.4%之間，RSD在3.4%～9.4%之間，檢出限在0.01～0.07 mg/L之間。

該方法系首次運用高分辨質(zhì)譜檢測大曲中的糖和糖醇，具有專屬性強、前處理簡單、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。同時運用該技術(shù)對醬香型高溫大曲中糖類物質(zhì)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)大曲中葡萄糖和甘露糖醇含量最高，果糖和麥芽糖次之，乳糖和蔗糖含量較低，且只有在部分大曲中含有，可進(jìn)一步對大曲發(fā)酵過程中糖及糖醇類物質(zhì)的變化進(jìn)行系統(tǒng)性分析，可在一定程度上為大曲中微生物代謝機制的研究提供新的思路和理論依據(jù)。