高效液相色譜法測定紅曲發(fā)酵食品中洛伐他汀的研究

張星星 ，毛清黎*，孫 俊，周念波，鐘小丹，吳季勤，顏 澤，陶 鑫，張 潔

（1.武漢生物工程學(xué)院校企共建功能米酒研發(fā)中心，湖北武漢 430415；2.武漢生物工程學(xué)院食品科技學(xué)院，湖北武漢 430415；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北孝感 432000；4.武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430415）

紅曲霉（Monascus）又名紅曲菌，主要采用大米為原料，接種紅曲霉進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)得到的一種紅色米曲，為我國一種較傳統(tǒng)的藥用真菌[1-3]。紅曲霉在發(fā)酵代謝過程中可產(chǎn)生紅曲色素、多糖、γ-氨基丁酸、麥角固醇、不飽和脂肪酸以及洛伐他汀等多種生理活性物質(zhì)，既可用于食品著色、腐乳制作、釀酒和疾病治療等，又有抗菌、降血脂、降血壓等作用[4]，在食品和醫(yī)藥行業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)市場上已有多種以紅曲為主要成分的中成藥，如“圣曲紅曲膠囊”和“血脂康”等，且療效顯著[3]。

洛伐他汀（lovastatin）為紅曲發(fā)酵中產(chǎn)生的一種生理活性物質(zhì)，有閉環(huán)的內(nèi)酯式和開環(huán)的β-羥基酸式兩種結(jié)構(gòu)[5-6]。研究表明，洛伐他汀不僅可有效阻斷內(nèi)源性膽固醇的合成，還具有保護(hù)腎臟、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗炎等作用[7-8]，因而日漸受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。市場上利用紅曲已開發(fā)出各類保健食品，如程亞運(yùn)[9]利用絲苗米、紅曲米和棗汁按一定比例混合，接種紅曲霉預(yù)發(fā)酵48 h，然后接種酵母，按比例調(diào)節(jié)料水比發(fā)酵得到紅曲棗酒；李燚[10]通過添加紅曲，分別制作出了紅曲酸奶和紅曲米酒，并考察了紅曲菌絲體添加量對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，類似文獻(xiàn)報(bào)道較多[11]，但大多集中在產(chǎn)品工藝研究；另一方面，洛伐他的汀含量分析則主要為藥物產(chǎn)品，如謝靜等[6]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對血脂康膠囊中洛伐他汀的含量進(jìn)行了檢測，程杰等[12]建立了一種測定脂必妥膠囊中洛伐他汀含量的HPLC法，而關(guān)于紅曲發(fā)酵食品中洛伐他汀的檢測分析也有一些報(bào)道，如李濤等[13]優(yōu)化了洛伐他汀有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法，莫永川等[14]建立了以紅曲為原料的保健食品中洛伐他汀含量測定的方法。

本研究根據(jù)洛伐他汀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，運(yùn)用反相液相色譜系統(tǒng)[16-20]，以常見的紫外檢測器建立了一種紅曲發(fā)酵食品中的洛伐他汀類物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，并對該方法的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性等問題進(jìn)行了較為深入、系統(tǒng)地研究，同時將其應(yīng)用于紅曲發(fā)酵食品的檢測中，為功能性紅曲發(fā)酵食品的質(zhì)量評價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛伐他汀標(biāo)樣（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸、乙醇（均為分析純）：國藥控股股份有限公司；甲醇（色譜純）：天津科密歐試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；紅曲：廣州市威倫食品有限公司；紅曲米酒、紅曲米：校企共建功能米酒研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

CH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市宏華儀器廠；Waters1525高效液相色譜儀：美國Waters公司；DHG-9055A實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BQS超聲波清洗儀：杭州寶珀超聲波科技有限公司；ME204T/02電子分析天平：梅特勒-托利多國際有限公司；TDZ5-WS臺式離心機(jī)：上海向帆儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取內(nèi)酯式洛伐他汀20.0 mg，以色譜甲醇溶解后，定容至10 mL，即得2.0 mg/mL的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液。將其依次以甲醇稀釋至1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、0.25 mg/mL、0.10 mg/mL、0.05 mg/mL等系列濃度。

酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確移取上述2.0 mg/mL的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)母液1 mL，加入0.2 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液至10 mL，充分混勻后，置于50 ℃下超聲清洗儀中，超聲轉(zhuǎn)化1 h，冷卻后靜置1 h，即為0.2 mg/mL的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液，后稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

內(nèi)酯式/酸式洛伐他汀混標(biāo)的配制：取0.1 mg/mL內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL和0.05 mg/mL酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，進(jìn)行混合，混勻后，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行測試分析。

1.3.2 洛伐他汀的HPLC分析條件

1.3.3 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

將上述系列濃度的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2的HPLC條件進(jìn)行分析，記錄各質(zhì)量濃度下的峰面積，以內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、1.00 mg/mL三種不同濃度的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，對每種質(zhì)量濃度下的標(biāo)液進(jìn)行一天測定5次及連續(xù)5 d的HPLC分析。根據(jù)記錄的峰面積計(jì)算其質(zhì)量濃度，并得出分析結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以評價(jià)上述方法的精密度。

1.3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別取洛伐他汀含量為0.25 mg/mL、0.50 mg/mL的兩種紅曲發(fā)酵食品樣品，向每種樣品中添加0.10 mL質(zhì)量濃度依次為0（空白對照）、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，按照1.3.2進(jìn)行HPLC分析，記錄目標(biāo)峰的峰面積，并計(jì)算出實(shí)際樣品濃度和樣品的加標(biāo)回收率。

1.3.6 食品中洛伐他汀含量的檢測

固體食品：取10 g食品樣品，研磨過40目篩，稱取混勻后的篩下物2 g于20 mL具塞試管中，向其中加入20 mL 75%的乙醇溶液，于40 ℃水浴中超聲提取1 h，冷卻后，分裝至離心管中離心10 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，合并上清液過濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

液體食品：搖勻后取樣，準(zhǔn)確移取1mL液體食品于20mL具塞試管中，向其中加入10 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇水溶液，于40 ℃水浴中超聲提取1 h，冷卻后，分裝至離心管中離心10 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，合并上清液過濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)液HPLC分析

取1.3.1中配制的洛伐他汀混標(biāo)溶液1 mL，按照方法1.3.2液相色譜方法進(jìn)行分析，其色譜結(jié)果見圖1。由圖1可知，酸式和內(nèi)酯式兩種洛伐他汀的保留時間依次為22.54 min和27.21 min，兩目標(biāo)峰峰形對稱性好，柱效較高，且分離度＞1.5，達(dá)到了基線分離的效果，效果非常顯著，這表明該色譜條件可作為兩種洛伐他汀的定性分析依據(jù)。

圖1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the lovastatin standard

2.2 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

將方法1.3.1所配制的0.05～1.00 mg/mL系列濃度的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液按照方法1.3.2的色譜條件分別進(jìn)行色譜分析，記錄各質(zhì)量濃度色譜峰面積，以內(nèi)酯式洛伐他汀的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，線性回歸方程為Y=3.03×107X+263 113（R2=0.999 8），表明在0.05～1.00 mg/mL質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，線性關(guān)系良好，靈敏度高，完全滿足定量分析要求。

圖2 內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2 Standard curve of lactone lovastatin

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為考察方法的精密度，取0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、1.00 mg/mL 3種不同質(zhì)量濃度的內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，對每種質(zhì)量濃度下的標(biāo)液進(jìn)行1 d內(nèi)測定5次以及連續(xù)5 d的HPLC分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，日內(nèi)5次重復(fù)測樣結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%～2.56%，回收率為96.12%～101.32%；連續(xù)日間5 d測樣結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%～2.64%，回收率為96.18%～102.01%。表明該方法具有較高的重現(xiàn)性、精密度和準(zhǔn)確度。同時表1結(jié)果也反映了該方法處理的樣品具有很好的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)樣品短時期的存放基本不會改變測定結(jié)果。然而該方法與測定藥品中的洛伐他丁的主要區(qū)別就在樣品的處理上，食品樣品組成復(fù)雜，因此對測定方法的要求則更高。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取已知洛伐他汀含量的紅曲發(fā)酵食品樣品，向其中添加一定量的內(nèi)酯式洛伐他汀對照品，充分混勻后，按照方法1.3.2進(jìn)行HPLC分析，記錄目標(biāo)峰的峰面積，并計(jì)算出實(shí)際樣品中洛伐他汀濃度和樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，所有食品樣品的加標(biāo)回收率均在99.01%～102.40%范圍內(nèi)，回收率結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.53%～3.54%范圍內(nèi)，表明該方法具備良好的精確度，可滿足分析要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of standard recovery rate experiments

2.5 紅曲發(fā)酵食品中內(nèi)酯式洛伐他汀含量的檢測

為了考察本方法對實(shí)際紅曲發(fā)酵食品樣品的分析效果，實(shí)驗(yàn)選取了紅曲、紅曲霉發(fā)酵的紅曲米酒以及紅曲米三種樣品，按實(shí)驗(yàn)方法的步驟進(jìn)行處理、分析，測試的結(jié)果見圖3。

圖3 幾種不同紅曲發(fā)酵食品樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of different Monascus fermented food samples

由圖3可知，紅曲樣品譜圖干擾峰較少，對測定基本上沒產(chǎn)生影響，紅曲米酒樣品譜圖中在12～18 min出現(xiàn)了少量的干擾峰，但相比于目標(biāo)物，其含量可忽略，紅曲米樣品譜圖中分別在8 min、16 min及20 min左右出現(xiàn)了干擾峰，且其含量較高，上述樣品譜圖的差異可能與紅曲發(fā)酵食品在制作過程中紅曲發(fā)酵所利用的底物及發(fā)酵條件不同，使得發(fā)酵食品產(chǎn)物成分較為復(fù)雜，此外，洛伐他汀與食品中其他各成分之間的結(jié)合能力也不同，導(dǎo)致溶劑提取時洛伐他汀的富集效果存在差異。雖然上述實(shí)際食品樣品成分比較復(fù)雜，但使用該方法測定時，譜圖中干擾峰較少，對測定基本上沒產(chǎn)生影響，說明該方法的選擇性很好，非常適合食品中洛伐他汀的測定。

從食品樣品中測得洛伐他汀平行3次結(jié)果見表3。由表3可知，檢測結(jié)果的RSD范圍在1.67%～4.85%，可知通過該方法檢測的食品中洛伐他汀含量重現(xiàn)性較好。比較3種食品中目標(biāo)峰的大小可知，紅曲樣中洛伐他汀含量最高，平均含量為1.559 mg/g，而由其發(fā)酵的食品產(chǎn)品紅曲米和紅曲米酒中洛伐他汀含量則較低，充分說明了紅曲食品在發(fā)酵過程中，洛伐他汀有所損失，如何在食品發(fā)酵過程中更好的保留洛伐他汀對食品發(fā)酵工藝提出了新的要求。

表3 不同紅曲發(fā)酵食品樣品中內(nèi)酯式洛伐他汀的含量Table 3 Lactone lovastatin content in different Monascus fermented food samples

3 結(jié)論

本文建立了一種HPLC法對紅曲發(fā)酵食品中的洛伐他汀類物質(zhì)進(jìn)行測定的方法。發(fā)酵紅曲食品樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶解，在40 ℃水浴下超聲提取1 h后離心，使用InertSustainC1（8250 mm×10 mm，5 μm）色譜柱，采用甲醇/0.3%磷酸溶液75∶25（V/V）為流動相，等度洗脫，保持柱溫30 ℃，流速1 mL/min，UV波長λ=238 nm的色譜條件下分析35 min。結(jié)果顯示該法在0.05～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，且日間和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.25%～2.64%、1.25%～2.56%，樣品的加標(biāo)回收率為99.01%～102.40%，該法不僅操作簡便、測試成本低廉，對儀器設(shè)備要求也較低，同時具備良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和精密度。在實(shí)際紅曲發(fā)酵食品樣品測試中干擾峰少，目標(biāo)峰形對稱，非常適合食品樣品中洛伐他汀類物質(zhì)的測定，可為功能性紅曲發(fā)酵食品的質(zhì)量評價(jià)提供參考依據(jù)。