益氣活血方對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響的研究

占天為 郭書文 陳曦 莫涵瑢 王惠 馮鵬飛 魏路路

缺血性心臟病是全球范圍內(nèi)人類死亡和致殘的主要原因。持續(xù)的心肌缺血會(huì)導(dǎo)致心臟組織的多重?fù)p害[1]。心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠狀動(dòng)脈疾病的常見表現(xiàn)，特征是持續(xù)性和嚴(yán)重心肌缺血引起部分心肌細(xì)胞死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡是受基因控制的程序性細(xì)胞死亡，并且是心肌細(xì)胞主要的細(xì)胞死亡方式[3]。細(xì)胞凋亡在心肌梗死的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用，終末分化心肌細(xì)胞的丟失引起心肌纖維化，心室擴(kuò)張，心臟重構(gòu)，心臟功能逐漸下降，加劇心力衰竭的發(fā)展[4]。由于心肌細(xì)胞的再生能力有限，靶向抑制凋亡成為改善心肌缺血損傷有前景的治療策略。研究表明，Bcl-2家族蛋白質(zhì)如Bcl-2和Bax，在調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡中起重要作用[4]。本研究旨在探討益氣活血方通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)對(duì)心肌梗死大鼠細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司訂購60只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，8周齡，SPF級(jí)，體重180～220 g，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)期間將動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度：(21±2)℃，濕度：(50±5)%，每天光照12小時(shí)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 益氣活血方由5味中藥組成：生黃芪50 g、生曬參10 g、當(dāng)歸15 g、三七6 g、川芎15 g，中藥材由北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供?？诜┲苽涔に嚕悍Q取40劑益氣活血方，中藥提取3次，第1次加10倍量水煎煮2小時(shí)，過濾，第2、3次分別將前1次過濾后得到的藥材在8倍量的水中煎煮1小時(shí)，共4小時(shí)，最后，將過濾后的溶液混勻，濃縮成含有0.82 g·mL-1生藥量的中藥煎劑。陽性對(duì)照藥培哚普利[施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)]，4 mg/片，國藥準(zhǔn)字：H20034053，臨用時(shí)以無菌蒸餾水充分溶解。主要試劑：一抗Bax、Bcl-2、c-caspase 3(英國Abcam公司ab182733、ab196495、ab49822)，辣根酶山羊抗兔IgG二抗(北京鼎國，SH-0031)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo，34094)。

1.2.2 儀器 Vevo770高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司生產(chǎn))，小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司，HW-101E)，心電圖機(jī)(廣州三銳電子科技有限公司，ECG-3312)，高壓滅菌鍋(日本Sanyo公司，MLS-3750)，石蠟包埋機(jī)(德國Leica，EG1150)。

1.3 心肌梗死大鼠模型的制備及分組

1.3.1 心肌梗死大鼠模型的制備 通過開胸手術(shù)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)的方法制備大鼠心肌梗死模型。大鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1) 麻醉后，仰臥位固定。垂直切開大鼠頸中部的皮膚，長度約1 cm。將皮下組織與頸部肌肉分開以暴露氣管。氣管橫向切開后，將氣管插管放置在第三或第四環(huán)狀軟骨的水平處，固定氣管插管后與動(dòng)物呼吸機(jī)相連以輔助大鼠呼吸。胸部備皮消毒后，沿左側(cè)3～4肋間間隙開胸，撕開心包膜后可見心臟。心臟大靜脈作為標(biāo)記，使用5/0帶線縫合針于左心耳下緣約2 mm位置結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。觀察左心室心肌的運(yùn)動(dòng)及顏色變化，室壁運(yùn)動(dòng)減弱、結(jié)扎部位及周圍心肌變白認(rèn)為手術(shù)結(jié)扎成功。排空胸腔積液，關(guān)閉胸腔，縫合皮膚切口。待大鼠麻醉清醒后撤掉呼吸機(jī)，隨后對(duì)大鼠進(jìn)行密切觀察，并在必要時(shí)按照手術(shù)程序進(jìn)行處理，以提高動(dòng)物的存活率。術(shù)后第二天進(jìn)行心電圖(ECG)檢查，圖紙中出現(xiàn)5～8個(gè)病理性Q波(觀察I、avL、V1-V6導(dǎo)聯(lián))表明模型制備成功。假手術(shù)組大鼠則將手術(shù)線穿過肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間，不進(jìn)行結(jié)扎，且無上述病理表現(xiàn)。

1.3.2 分組及給藥 將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(即對(duì)照組)、模型組、益氣活血組、培哚普利組，每組10只。益氣活血組從手術(shù)次日開始每日給予8.2 g·kg-1·d-1(經(jīng)課題組前期研究確定的劑量)的中藥灌胃治療。培哚普利組：手術(shù)次日開始灌胃給藥，根據(jù)等效劑量換算公式計(jì)算出給藥量：0.4 mg·kg-1·d-1。其余各組大鼠均給予與治療組相同體積的無菌蒸餾水灌胃作對(duì)照。每日1次，連續(xù)給藥4周并檢測各組大鼠第28天心肌組織的指標(biāo)情況。

1.4 超聲檢測心臟左室功能

術(shù)后4周通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，備皮，使用30 MHz高分辨率Vevo 770小動(dòng)物超聲儀器探頭進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，以評(píng)估左心室的結(jié)構(gòu)和功能。記錄左心室短軸乳頭肌水平上獲得的M型曲線，從三個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期中獲取參數(shù)并取平均值。參數(shù)包括：左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular shortening fraction, LVFS)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)。

1.5 HE染色

通過HE染色評(píng)估左心室心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。用4%多聚甲醛固定心臟組織，固定24小時(shí)后石蠟包埋，制成5 μm切片，切片去石蠟，再水化，使用蘇木精-曙紅(HE)染色。通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌梗死邊緣區(qū)組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(放大倍數(shù)，×200)。

1.6 TUNEL染色測定心肌細(xì)胞凋亡

使用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行TUNEL染色。將4%多聚甲醛固定的心臟組織石蠟包埋，制成4 μm切片。脫石蠟后，切片與蛋白酶溶液在37°C下反應(yīng)5分鐘，隨后加入TdT反應(yīng)溶液(TdT∶TdT底物溶液=1∶100)，10分鐘。室溫下，于3%H2O2封閉液中封閉5分鐘以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片與過氧化物酶(POD)偶聯(lián)抗體孵育10分鐘，37°C。室溫下，切片與DAB+底物色原系統(tǒng)(Dako)孵育5分鐘，使TUNEL陽性細(xì)胞核顯色。細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染。使用配備有顯微鏡攝像頭的光學(xué)顯微鏡獲得圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，對(duì)各組的凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI=陽性凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.7 Western blot檢測梗死邊緣區(qū)Bax、Bcl-2、C-caspase 3蛋白表達(dá)

取用梗死邊緣區(qū)域的心肌組織樣品，用于蛋白質(zhì)分析。心臟組織樣品中加入含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液，研磨成勻漿，并使用BCA蛋白測定試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。將40 μg蛋白質(zhì)樣品在12%SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。使用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉PDVF膜2小時(shí)，并與以下一抗在4°C下過夜孵育：Bax(1∶2000)，Bcl-2(1∶1000)，C-caspase3(1∶500)。用TBST緩沖液洗滌后，將PDVF膜與二抗(山羊抗兔IgG，濃度1∶5000)孵育2小時(shí)。應(yīng)用ECL檢測試劑盒使蛋白質(zhì)條帶可視化，膠片曝光。對(duì)膠片進(jìn)行掃描，使用Image J軟件計(jì)算目的條帶灰度值，各組蛋白分別與內(nèi)參β-action作比值得出相對(duì)光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS均降低(P<0.01)，LVESD、LVEDD均升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血組和培哚普利組大鼠LVEF、LVFS均升高(P<0.01)，LVESD、LVEDD均降低(P<0.01)。見表1。

2.2 各組大鼠HE染色結(jié)果

HE染色后，假手術(shù)組大鼠左心室的心肌細(xì)胞彼此平行且在光學(xué)顯微鏡下呈有序排列。細(xì)胞結(jié)構(gòu)未被破壞，大小正常，中心是橢圓形的核，橫向條紋明顯可見。模型組大鼠心肌細(xì)胞萎縮，細(xì)胞色素沉著，細(xì)胞質(zhì)增生，心肌纖維斷裂。還觀察到炎性細(xì)胞的浸潤以及纖維細(xì)胞和纖維成分的增加。益氣活血組和培哚普利組染色相對(duì)均勻，梗死部位的纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤較模型組得到了改善，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度較輕。見圖1。

2.3 各組大鼠TUNEL染色結(jié)果

凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色，而非凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞核基本呈藍(lán)色，偶有幾個(gè)陽性細(xì)胞核。心肌梗死后28天，在模型組中，梗死區(qū)域周圍的細(xì)胞主要是凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，益氣活血組和培哚普利組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡指數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖2。

表1 各組大鼠心臟超聲數(shù)據(jù)結(jié)果比較

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：益氣活血組；D：培哚普利組。圖1 各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞染色結(jié)果(HE×200)

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：益氣活血組；D：培哚普利組。圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡染色結(jié)果(TUNEL×400)

表3 益氣活血方對(duì)大鼠梗死邊緣區(qū)Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、C-caspase3蛋白表達(dá)的作用

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05。

表2 各組大鼠心肌組織TUNEL染色凋亡指數(shù)結(jié)果

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.4 各組大鼠Western blot檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的Bax、C-caspase 3均升高(P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)及Bcl-2/Bax降低(P<0.01)，說明心肌梗死后模型組大鼠的細(xì)胞凋亡程度較重。與模型組比較，益氣活血組大鼠Bax蛋白表達(dá)有所下降(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)與Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05，P<0.01)，C-caspase 3蛋白表達(dá)有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培哚普利組大鼠Bax表達(dá)降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值上升(P<0.05)，Bcl-2呈升高趨勢，C-caspase 3有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。

注：J：假手術(shù)組；M：模型組；Z：益氣活血組；P：培哚普利組。圖3 各組大鼠蛋白表達(dá)電泳結(jié)果

3 討論

益氣活血方在當(dāng)歸補(bǔ)血湯的基礎(chǔ)上加人參、川芎、三七配伍而成，是郭書文教授治療胸痹心痛的經(jīng)驗(yàn)用藥，臨床上對(duì)于心肌缺血有較好的治療效果[5]，經(jīng)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血方具有多種藥理作用，包括抗炎、抗纖維化和神經(jīng)保護(hù)特性[6-8]。本實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)典的心肌梗死大鼠模型以探究益氣活血方對(duì)心肌梗死大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能以及心肌細(xì)胞凋亡損傷的保護(hù)機(jī)制，為使益氣活血方的藥效評(píng)價(jià)更加客觀，選用培哚普利[9]作為陽性對(duì)照藥。

心肌梗死是心血管疾病患者的常見死亡原因。心肌梗死常發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)異常，心臟舒張和收縮功能降低，心肌耗氧量增加[10]。在這項(xiàng)研究中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVEF和LVFS顯著降低，LVEDD和LVESD升高。與模型組相比，益氣活血組的LVEF、LVFS上升，LVEDD和LVESD明顯下降，這表明益氣活血方可改善心臟的收縮和舒張功能，改善心室順應(yīng)性，減輕心肌缺血損傷。

心肌是終末分化的組織，因此發(fā)生缺血性疾病時(shí)保持心肌細(xì)胞的活力至關(guān)重要。缺血性心臟中細(xì)胞凋亡廣泛存在，特別是在梗死周圍區(qū)域，在很大程度上阻礙了心臟功能的恢復(fù)。因此，在心肌缺血期間抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生對(duì)于保護(hù)心臟功能至關(guān)重要。Bcl-2家族是凋亡通路的有效調(diào)節(jié)劑，它既包括抗凋亡蛋白又包括促凋亡蛋白?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[11]。Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞凋亡是否發(fā)生，增加Bax/Bcl-2比值激活凋亡途徑，與此同時(shí)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)或降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)能夠抑制線粒體凋亡途徑[12]。caspase家族在一定程度上對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)也很重要。caspase 3是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶激酶家族的成員，caspase 3的激活可以引起心肌細(xì)胞凋亡。凋亡蛋白酶激活因子1、細(xì)胞色素-C和caspase-9的結(jié)合激活下游的caspase 3從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡的Bax和caspase-9能夠誘導(dǎo)C-caspase 3的表達(dá)，而抗凋亡的Bcl-2能抑制其表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與模型組相比，益氣活血方干預(yù)組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高，Bax表達(dá)降低，但對(duì)C-caspase 3蛋白的下調(diào)作用不顯著。表明益氣活血方通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)抗凋亡因子的表達(dá)，減少促凋亡因子的釋放抑制細(xì)胞凋亡，這可能是益氣活血方保護(hù)心肌缺血性損傷的機(jī)制。綜上推測，益氣活血方通過有效調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax的表達(dá)以改善與凋亡相關(guān)的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。