特異性GTP酶YchF及其在蛋白質(zhì)生物合成中的功能研究進(jìn)展

巴巧瑞，王弋博，焦成瑾

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

YchF是E.coli中的一種普遍保守的ATP酶，由ychF基因編碼。[1]比較基因組研究發(fā)現(xiàn)，YchF同源物存在于所有測序的基因組中，且廣泛分布于原核生物、真核生物以及古菌中。這表明活細(xì)胞中YchF樣蛋白可能具有基本且重要的功能。[2]大腸桿菌基因組中，ychF與Pth（肽酰tRNA水解酶）共轉(zhuǎn)錄，Pth是水解肽酰tRNA的酶，它可催化釋放tRNA。[3]實(shí)驗(yàn)證明YchF水解ATP的效率遠(yuǎn)高于GTP。但根據(jù)結(jié)構(gòu)，其被歸為TRAFAC（翻譯因子相關(guān)）家族，這一家族成員為普遍保守的GTP酶，功能均與核糖體合成蛋白質(zhì)相關(guān)，表明YchF可能也參與蛋白質(zhì)生物合成過程，且由于特殊的水解活性，很可能在一些特殊的情況下行使自身功能，例如氧化應(yīng)激等。在人體中，核糖體異常通常可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，且ATP酶是非常具有吸引力的藥物靶點(diǎn)。[4]因此，揭示YchF與核糖體的相互作用能補(bǔ)充核糖體生物學(xué)相關(guān)研究，并有助于開發(fā)治療因核糖體異常所導(dǎo)致疾病的藥物。

YchF同源物之間的序列十分相似，例如，大腸桿菌YchF與人源類似Obg家族G蛋白的ATP水解酶1（human Obg-like ATPase 1,hOLA1）蛋白在組成上，45%的氨基酸完全相同并且一半以上的氨基酸具有相似性，強(qiáng)烈暗示了這兩種蛋白質(zhì)在功能上具有保守性。[5]據(jù)報(bào)道敲除hOLA1能抑制乳腺癌細(xì)胞遷移與增殖，[6]同時(shí)細(xì)胞對活性氧（ROS）的抵抗力更強(qiáng)。此外，在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)hOLA1表達(dá)上調(diào)，這也表明靶向YchF／OLA1可能對腫瘤有潛在的治療作用。然而，YchF／OLA1在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)作用仍待進(jìn)一步研究。[7]

YchF／OLA1的普遍保守性表明了該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中可能具有非?；A(chǔ)且重要的功能，[2]但ychF的缺失對人類、枯草芽孢桿菌或大腸桿菌都有一定但并不致命的影響。[6,8]Fernebro發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌ychF缺失株表現(xiàn)出一定的生長缺陷，[9]在大腸桿菌中，?ychF菌株則為冷敏感表型。[10]這些觀察結(jié)果表明，至少在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，YchF／OLA1不參與細(xì)胞的基礎(chǔ)生命活動。那么YchF作為廣泛保守的ATP酶，究竟參與細(xì)胞生命的哪些作用呢？

1 YchF的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

YchF的第一個晶體結(jié)構(gòu)來自裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），于2003年發(fā)表。[11]隨后，流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenza）YchF、嗜熱菌（Thermusthermophiles）YchF和hOLA1晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析。[11-12]在這些來自不同生物體的蛋白質(zhì)中，不僅在保守的G結(jié)構(gòu)域（G-domain）內(nèi)，而且在其他兩個結(jié)構(gòu)域內(nèi)都觀察到了結(jié)構(gòu)的高度相似性。[13]YchF由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成。N-端的G結(jié)構(gòu)域是P-環(huán)ATP/GTP酶的典型結(jié)構(gòu)域，其后是一個假定的α-螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域（A-domain），最后是C-端TGS結(jié)構(gòu)域（ThrRS，GTP酶，SpoT）（圖1）。這三個結(jié)構(gòu)域通過松散的多肽鏈連接，形成一個蟹鉗狀結(jié)構(gòu)，在A結(jié)構(gòu)域和TGS結(jié)構(gòu)域之間有20?的間隙。這種特殊的結(jié)構(gòu)對于YchF／OLA1蛋白質(zhì)家族來說似乎是獨(dú)一無二的。[12]一般來說，蛋白質(zhì)是由有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，新結(jié)構(gòu)域的出現(xiàn)可以很好地預(yù)測蛋白質(zhì)功能。[14]因此，研究單個結(jié)構(gòu)域的特征和包含這些結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)功能將為預(yù)測可能的YchF功能提供有用信息。

圖1 流感嗜血桿菌YchF的晶體結(jié)構(gòu)

1.1 P-環(huán)GTP酶

由于在N端具有GTP結(jié)合域（G結(jié)構(gòu)域），因此YchF首先被歸類為P-環(huán)GTP酶，是一組能夠結(jié)合并水解鳥苷三磷酸（GTP），生成鳥苷二磷酸（GDP）的蛋白質(zhì)。[15]它們在細(xì)胞中通常充當(dāng)分子開關(guān)，觸發(fā)下游蛋白質(zhì)的作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)各種重要的細(xì)胞過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)以及核糖體生物合成。[14]結(jié)構(gòu)保守的G結(jié)構(gòu)域由六個平行的β折疊片組成，被α螺旋包圍，在許多核苷酸結(jié)合蛋白中都可以發(fā)現(xiàn)這樣的結(jié)構(gòu)。[16]在序列水平上，G結(jié)構(gòu)域具有幾個保守的序列模體（G1-G5），并存在于所有的P環(huán)GTP酶中。G1模體（GXXXXGKS）也被稱為Walker A或P-loop模體，它的作用是在催化中心內(nèi)定位核苷酸三磷酸。G2〔X（T/S）X〕和G3（DXXG）模體（Walker B）協(xié)調(diào)Mg2+結(jié)合。這兩個模體也被稱為開關(guān)I和II，可以通過構(gòu)象變化激活下游蛋白質(zhì)；在GTP酶的同一個亞家族中兩個模體都很保守。[17]基于G結(jié)構(gòu)域中保守的序列模體和結(jié)構(gòu)模體，P環(huán)GTP酶可分為兩大類：TRAFAC（翻譯因子）類和SIMIBI（信號識別顆粒）類。[18]除了保守的P-環(huán)G-結(jié)構(gòu)域外，P-環(huán)GTP酶還包含一個或多個額外的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)這些額外結(jié)構(gòu)域的序列和結(jié)構(gòu)特征，P-環(huán)GTP酶又被細(xì)分為4個超家族、8個家族和13個子家族。YchF亞家族屬于TRAFAC類Obg（spo0B相關(guān)GTP結(jié)合蛋白）家族。YchF亞家族成員不同于其他GTP酶，因?yàn)樗鼈儍A向于水解ATP而不是GTP。[17-18]據(jù)報(bào)道，hOLA1（人）、YchF（大腸桿菌、流感嗜血桿菌）、OLA1p（釀酒酵母）和TcYchF（T.cruzi）都具有更高的水解ATP效率而不是GTP。[19-21]有人認(rèn)為這種核苷酸特異性的改變可能是由于YchF的G4模體中保守的賴氨酸和天冬氨酸殘基的變化。然而，將hOLA1G4模體（NLSE）回復(fù)到之前的GTP酶模體（NKXD）并不會改變易于水解ATP的特異性。[13]另有報(bào)道YchF樣蛋白在G3模體下游缺乏催化性的組氨酸／谷氨酸，而這兩個氨基酸的存在也是蛋白質(zhì)具有GTP酶活性的關(guān)鍵。[22]因此，YchF類蛋白易于水解ATP的特異性還可能來自G3模體后組氨酸／谷氨酸的缺失而不僅僅是G4模體序列的改變。

1.2 具有G結(jié)構(gòu)域的YchF歸屬于GTP酶家族

在真核生物、細(xì)菌和古細(xì)菌中存在一組普遍保守的GTP酶，包括IF-2、EF-Tu、EF-G、Ffh、Ft-sY、YihA、HflX和YchF，其中IF-2、EF-Tu和EF-G是翻譯因子超家族成員。[23-25]Ffh和FtsY分別是細(xì)菌信號識別粒子蛋白及其受體，參與蛋白質(zhì)靶向調(diào)節(jié)。[26]YihA參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，并被證明在核糖體生物合成過程中對50S亞基的成熟起重要作用。[27]據(jù)報(bào)道，HflX與肺炎支原體和大腸桿菌50S核糖體亞基相互作用，被認(rèn)為在核糖體組裝中具有特定功能。[28]這些普遍保守的GTP酶既是翻譯所必需的（IF-2，EF-Tu，EF-G），也是核糖體生物發(fā)生過程中需要的（YihA，HflX），更是靶向共翻譯蛋白所必需的（Ffh，F(xiàn)tsY）。因此推測：YchF／OLA1也具有與核糖體相關(guān)的功能。

1.3 YchF的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（A結(jié)構(gòu)域）和TGS結(jié)構(gòu)域

YchF／OLA1的晶體結(jié)構(gòu)揭示了蛋白質(zhì)還具有一個由兩個長α-螺旋構(gòu)成的α-卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄延伸因子（GreA）、RNA聚合酶（DksA）和seryl-tRNA合成酶（SerRS）中發(fā)現(xiàn)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域具有高度相似性。[29-32]GreA誘導(dǎo)停滯轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中新生轉(zhuǎn)錄物的3'-端斷裂，以重新釋放被抑制的復(fù)合物，因此其作用在概念上類似于Pth在失速核糖體中的挽救作用。[32]DksA是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要組成部分，作為對細(xì)胞中ppGpp積累的響應(yīng)，它抑制rRNA、部分核糖體蛋白和tRNA的轉(zhuǎn)錄。GreA和DksA都直接與RNA聚合酶（RNAP）相互作用，將其卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)域插入RNAP的二級通道，使結(jié)構(gòu)域的頂端接觸轉(zhuǎn)錄物的3'端并誘導(dǎo)鏈的斷裂。[30]與GreA和DksA不同，SerRS的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與SertRNA的可變臂和TΨC環(huán)接觸，從而介導(dǎo)受體莖環(huán)的定位。[31]總之，結(jié)構(gòu)上相關(guān)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域似乎與RNA的結(jié)合和質(zhì)量控制有關(guān)。

TGS結(jié)構(gòu)域（ThrRS、GTP酶和SpoT）是一個由約50個氨基酸組成的小結(jié)構(gòu)域，可折疊成5條β-鏈和2到3條α-螺旋。[33]YchF和ThrRS（蘇氨酸-tRNA合成酶）TGS結(jié)構(gòu)域具有高度的相似性，但ThrRS的TGS結(jié)構(gòu)域不參與tRNA結(jié)合。[34]流感嗜血桿菌YchF的TGS結(jié)構(gòu)域顯示出保守的氨基酸殘基序列，這些保守序列形成一個連續(xù)的帶電荷的區(qū)域，理論上易于結(jié)合RNA。[12]但是目前還缺乏RNA結(jié)合的實(shí)驗(yàn)證據(jù)?？傊琘chF中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和TGS結(jié)構(gòu)域的存在，表明此蛋白質(zhì)可能在RNA和蛋白質(zhì)相互作用中起特定作用。

2 YchF／OLA1在核糖體蛋白質(zhì)合成中的潛在功能

有研究發(fā)現(xiàn)YchF可能在核糖體組裝或核糖體功能中具有一定的作用。YchF表達(dá)會因DNA損傷而下調(diào)，這意味著YchF蛋白可能在蛋白質(zhì)生物合成過程中有一定的作用。[35]在許多大腸桿菌中，ychF與Pth共同轉(zhuǎn)錄，Pth編碼Pth（肽酰tRNA水解酶），它水解肽酰tRNA釋放游離的tRNA，從而維持細(xì)胞內(nèi)tRNA水平的穩(wěn)定。[36]在大腸桿菌中，Pth的mRNA在沒有ychF的情況下不能穩(wěn)定存在。[1]表明這兩種蛋白之間可能存在關(guān)聯(lián)，并暗示了YchF在翻譯中的作用。在水稻上的研究顯示OsY-chF1的TGS結(jié)構(gòu)域在體外與26S rRNA結(jié)合，間接支持OsYchF1和核糖體相互作用，說明YchF參與蛋白質(zhì)的翻譯過程。[37]最近，在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了YchF能夠與50S和70S核糖體亞基分別結(jié)合，并且YchF的ATP酶活性在體外受到70S核糖體的激活。[19-20]Feng提出了一個解釋YchF參與核糖體活性的機(jī)理模型：首先，YchF需要和ATP結(jié)合形成二元復(fù)合物YchF·ATP，然后才能與70S核糖體結(jié)合，而70S核糖體作為一種激活劑，刺激YchF的ATP酶活性，使得ATP水解為ADP，之后YchF·ADP離開70S核糖體重新循環(huán)生成YchF·ATP，以進(jìn)行下一輪核糖體結(jié)合（圖2）。該模型說明了YchF以ATP介導(dǎo)的方式調(diào)節(jié)70S核糖體的功能。[16,19]然而，YchF與核糖體結(jié)合的生理學(xué)機(jī)理還不明確。在細(xì)胞中，許多GTP酶直接與核糖體亞單位結(jié)合，并作為核糖體生物合成啟動因子在核糖體組裝過程中招募核糖體蛋白質(zhì)。[8,38]或許，隸屬于GTP酶家族的YchF也具有相似的功能？

圖2 YchF參與核糖體生物學(xué)功能的模型

3 蛋白生物合成的影響因素

核糖體是一種高度復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)器，根據(jù)mRNA上編碼的遺傳信息合成蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)是完成多種細(xì)胞功能所必需的重要大分子。因此，翻譯精度是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的一個基本因素，關(guān)乎細(xì)胞的存亡大事，所以細(xì)胞會對蛋白質(zhì)合成這一重要生命活動所必需的控制體系進(jìn)行精確地調(diào)控。[39]例如，細(xì)胞往往在幾個點(diǎn)上控制蛋白質(zhì)翻譯的準(zhǔn)確性，在源頭上通過相應(yīng)的氨基酰tRNA合成酶對tRNA和氨基酸進(jìn)行特異性連接，從而減少錯誤氨基酸的引入；[40]在合成過程中，成功識別釋放因子和終止密碼子減少過早終止和過晚終止。[41]然而，生物個體不可避免地暴露在不利的環(huán)境條件下，如氧化應(yīng)激。當(dāng)細(xì)胞受到壓力時(shí)，由于RNA和蛋白質(zhì)關(guān)鍵翻譯元素的氧化和不可逆修飾，蛋白質(zhì)合成不能像正常情況下那樣精確。氧化的mRNAs不能正確翻譯，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降和蛋白質(zhì)正常功能喪失。[42-43]有研究表明，真核細(xì)胞mRNAs的氧化可導(dǎo)致核糖體失速加劇和蛋白質(zhì)翻譯速度降低。在氧化應(yīng)激下，Glu-tRNA可被氧化，Phe-tRNA的結(jié)合親和力顯著降低。[44]另一方面，與mRNA和rRNA相比，tRNA受氧化應(yīng)激的影響較小，因?yàn)閠RNA與ROS的結(jié)合比rRNA低，氧化應(yīng)激對tRNAs的有害影響更多的是通過相應(yīng)的tRNA合成酶，有些tRNA合成酶可能部分或完全失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)誤譯。[45]

在整個生命周期中，細(xì)胞需要對環(huán)境變化做出靈活的應(yīng)激反應(yīng)，因此，細(xì)胞需要復(fù)雜的傳感和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生理反應(yīng)以響應(yīng)環(huán)境信息和內(nèi)部信號，保證細(xì)胞在變化多端的環(huán)境中生存下去。應(yīng)激反應(yīng)涉及基因表達(dá)的調(diào)控、代謝調(diào)控和酶活性的改變。通常溫度發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)熱休克蛋白，而面對氧化應(yīng)激時(shí)則表達(dá)抗氧化酶。[46-47]此外，除了上調(diào)應(yīng)激蛋白之外，還可以下調(diào)其他蛋白質(zhì)從而增加細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)的適應(yīng)能力，保證細(xì)胞的存活。綜上所述，在大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)胞遇到氧化應(yīng)激時(shí)，YchF被下調(diào)，而敲除YchF則促進(jìn)氧化應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活。[21,48]在YchF的真核同源物中，OLA1的敲除導(dǎo)致細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗力增強(qiáng)；在人類細(xì)胞中，hOLA1通過將延伸起始因子eIF2轉(zhuǎn)化為GDP結(jié)合狀態(tài)從而抑制蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的生存。[49-50]hOLA1在應(yīng)激條件下的特異反應(yīng)使它成為腫瘤或癌癥治療中的潛在藥物靶點(diǎn)。然而，有關(guān)YchF及其同源蛋白在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成調(diào)控方面的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。真核生物相較于原核生物具有龐大的基因組和復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此，首先在相對簡單的模式生物——大腸桿菌中確定YchF在蛋白翻譯和應(yīng)激反應(yīng)中的確切分子功能。再將結(jié)果轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中，有助于更好地揭示YchF／OLA1與癌癥以及由核糖體導(dǎo)致的疾病之間的聯(lián)系。

4 展望

結(jié)合YchF的結(jié)構(gòu)以及目前的研究結(jié)果，建議未來對YchF的研究從以下幾個方面進(jìn)行：（1）YchF是TRFAC家族GTP酶中的一員，其中許多蛋白參與核糖體的生物發(fā)生和組裝。因此，首先分析野生型和ychF缺失菌株中核糖體濃度、核糖體組裝情況是必要的。可利用蛋白免疫沉淀檢測核糖體大、小亞基蛋白來檢測細(xì)胞內(nèi)核糖體濃度。通過繪制YchF表達(dá)或者缺失菌株中核糖體的分布曲線，并與野生型菌株進(jìn)行比較，可明確YchF對核糖體組裝是否有顯著影響。（2）ychF缺失菌株雖然可以存活但表現(xiàn)出一定生長缺陷，這可能是蛋白質(zhì)合成障礙所導(dǎo)致的生長遲緩。因此建議測定不同YchF濃度下，活體細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成水平。