丹蛭降糖膠囊對糖尿病模型大鼠心、腎組織的影響

賈會玉，李 睿，賈德云，馬 征，李心偉，王 超，羅勝勇*

(安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理研究所，安徽 合肥 230061)

近幾十年，我國成年人糖尿病患病率顯著增加，從1980年的0.67%升至2013年的10.4%，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害健康的慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病患者長期處于較高的血糖水平，進(jìn)而引發(fā)一系列并發(fā)癥，腎臟及心臟是最為容易出現(xiàn)病變的臟器之一。糖尿病患者中有20%～40%發(fā)生糖尿病慢性腎病，是糖尿病患者腎功能衰竭的主要原因。糖尿病是心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，中國冠心病患者的糖代謝異?；疾÷?包括糖尿病前期和糖尿病)約為80%[2]?？梢娞悄虿〖捌淠I臟、心臟并發(fā)癥已成為亟待解決的問題。丹蛭降糖膠囊是根據(jù)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科經(jīng)驗(yàn)方研制而成的院內(nèi)制劑(皖藥制字Z20090006)，已獲得國家發(fā)明專利(專利號ZL200310112845.1)，具有穩(wěn)定可靠的降糖作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以Ⅱ型糖尿病大鼠模型為研究對象對丹蛭降糖膠囊是否能影響模型大鼠心、腎改變進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

丹蛭降糖膠囊，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物制劑中心提供。鏈脲佐菌素，美國Sigma公司。鏈脲佐菌素溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用時(shí)，用pH=4.4的滅菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)配成濃度為2%的溶液，并在30 min內(nèi)注射完畢。鹽酸吡格列酮，購于杭州中美華東制藥有限公司。糖原PAS及Masson試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

3月齡清潔級健康雄性SD大鼠70只，購于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)證號scxk(皖)2017-2018，平均體質(zhì)量(200±20)g。分籠喂養(yǎng)，大鼠自由飲食，保持良好的通風(fēng)環(huán)境，以及適宜的溫度和濕度。

1.3 動物模型制作與分組

70只3月齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)挑選10只作為正常組正常飼養(yǎng)，其余大鼠高脂飼料(蛋白質(zhì)24%、脂肪25%、碳水化合物51%)喂養(yǎng)4周后按34 mg/kg注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制作Ⅱ型糖尿病大鼠模型，72 h后檢測隨機(jī)血糖濃度，若≥13.8 mmol/L為造模成功。造模不成功大鼠按25 mg/kg腹腔補(bǔ)充注射STZ，亦是以隨機(jī)血糖濃度≥13.8 mmol/L為成功標(biāo)準(zhǔn)[5]。成模大鼠40只隨機(jī)分為4組：模型組、高劑量丹蛭降糖膠囊組、低劑量丹蛭降糖膠囊組、吡咯列酮組，每組各10只，每組大鼠之間體質(zhì)量、血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)6周。

1.4 劑量設(shè)計(jì)與給藥

按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]中列出的人與動物間體表面積等效劑量比值，計(jì)算出大鼠低劑量組丹蛭降糖膠囊劑量為0.54 g/(kg·d)；高劑量組丹蛭降糖膠囊劑量為1.08 g/(kg·d)；吡格列酮組給予鹽酸吡格列酮10 mg/(kg·d)。正常組與模型組應(yīng)給予生理鹽水5 mL/(kg·d)。給藥劑量皆為10 mL/kg，灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥6周。末次給藥后，留尿，禁食12 h，麻醉取血，處死取材。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 一般體征檢測 造模后檢測大鼠體質(zhì)量。給藥6周后，檢測大鼠體質(zhì)量及24 h攝食量、攝水量。

1.5.2 血糖血脂水平檢測 造模后檢測大鼠隨機(jī)血糖。給藥6周后，檢測大鼠隨機(jī)血糖，腹主動脈取血，檢測大鼠糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A-1，HbA1c)、總膽固醇(total cholestrol，TC)、總甘油三酯(triglyceride，TG)。

1.5.3 腎功能指標(biāo)檢測 末次給藥后，收集24h尿液，測定尿微量白蛋白(micro albuminuria，mAlb)、尿蛋白。腹主動脈取血，測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，血肌酐(serum creatinine，Scr)值。

1.5.4 大鼠心、腎組織的病理學(xué)觀察 末次給藥后，分別取大鼠心、腎組織，包埋，切片，心臟進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，馬松染色法(masson staining,MASSON)染色，腎臟進(jìn)行HE、過碘酸-雪夫((Periodic Acid-Schiff stain，PAS)、MASSON染色，觀察大鼠心、腎組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、纖維化及腎小球腎小管基底膜增厚情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般體征

各組大鼠的體質(zhì)量、攝食量和攝水量見表1。造模后，相較正常組，模型組大鼠體質(zhì)量下降(P＜0.01)，攝食量與攝水量增加(P＜0.01)，出現(xiàn)糖尿病典型“三多一少”癥狀。給藥后，相較于模型組，各給藥組大鼠體質(zhì)量增加(P＜0.01)，攝食量與攝水量降低(P＜0.01或P＜0.05)。

表1 各組大鼠的體質(zhì)量、攝食量和攝水量(，n=10)

與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別正常組模型組高劑量丹蛭降糖膠囊組低劑量丹蛭降糖膠囊組吡格列酮組體質(zhì)量/g制模后373.33±31.18 352.14±24.16 348.21±25.73 351.91±23.44 349.28±25.67治療后449.56±59.82 368.09±50.78ΔΔ 426.00±33.57**434.25±32.14**446.66±41.86**攝食量/(g/d)24.10±3.72 42.25±5.26ΔΔ 35.64±4.92**37.89±4.27*34.84±6.83**攝水量/(mL/d)40.12±7.79 124.37±8.34Δ 40.79±7.63**53.06±8.64**59.48±9.43**

2.2 血糖和血脂水平

各組大鼠的血糖和血脂水平見表2。造模后，與正常組比較，模型組大鼠血糖濃度升高(P＜0.01)；6周后，模型組大鼠血糖依然維持在高位，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，HbAlc、TG、TC水平較正常組升高(P＜0.01)。給藥6周后，高劑量丹蛭降糖膠囊組與吡格列酮組大鼠血糖、HbAlc、TG、TC水平較模型組明顯下降(P＜0.01)。低劑量丹蛭降糖膠囊與模型組相比，除TC外其余指標(biāo)（血糖、HbAlc、TG）均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。與吡格列酮組相比，低劑量組大鼠HbAlc、TG、TC水平出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表2 各組大鼠的血糖和血脂水平(，n=10)

與正常組比較，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與吡格列酮組比較，#P＜0.05

2.3 腎功能

各組大鼠的腎功能各項(xiàng)指標(biāo)見表3。與正常組相比，模型組大鼠BUN、Scr、mAlb、尿蛋白量水平明顯升高(P＜0.01)；給藥6周后，高、低劑量丹蛭降糖膠囊組與吡格列酮組BUN、Scr、mAlb、尿蛋白量水平較模型組明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)；與吡格列酮組相比，低劑量組mAlb水平升高(P＜0.01)。

表3 各組大鼠的BUN、Scr、mAlb、尿蛋白量水平比較(，n=10)

表3 各組大鼠的BUN、Scr、mAlb、尿蛋白量水平比較(，n=10)

與正常組比較，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與吡格列酮組比較，##P＜0.01.

組別正常組模型組高劑量丹蛭降糖膠囊組低劑量丹蛭降糖膠囊組吡格列酮組BUN/(mmoL/L)4.82±1.87 15.26±5.63ΔΔ 8.64±4.03**10.31±4.21*9.37±3.83**Scr/(μmol/L)25.04±9.16 76.52±18.31ΔΔ 52.32±13.32**60.31±11.37**51.48±16.21**mAlb/(mg/d)12.21±3.91 178.42±27.13ΔΔ 113.85±12.78**145.59±17.27**##120.47±20.58**尿蛋白量/(mg/d)12.45±2.94 37.25±8.73ΔΔ 20.51±5.61**28.14±7.92**23.62±8.34**

2.4 病理組織學(xué)觀察

2.4.1 心臟HE染色 如圖1所示，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻，心肌纖維排列整齊；模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核增大，形態(tài)不規(guī)則，核仁濃染，胞漿染色加深，心肌纖維增粗，排列紊亂；各給藥組大鼠鼠心肌細(xì)胞病理改變較模型組減輕。

A；正常組；B：模型組；C：高劑量丹蛭降糖膠囊組；D：低劑量丹蛭降糖膠囊組；E：吡格列酮組.圖1 各組大鼠心臟HE染色后的病理組織學(xué)觀察(×100)

2.4.2 心臟MASSON染色 MASSON染色纖維細(xì)胞呈藍(lán)染，由圖2可知，較正常組，模型組大鼠心肌纖維化明顯，各給藥組心肌細(xì)胞纖維化程度較模型組明顯減輕。

A；正常組；B：模型組；C：高劑量丹蛭降糖膠囊組；D：低劑量丹蛭降糖膠囊組；E：吡格列酮組.圖2 各組大鼠心臟MASSON染色后的病理組織學(xué)觀察(×100)

2.4.3 腎臟HE染色 由圖3可見，正常組腎小球結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小正常，血管球、與腎小球囊腔的比例正常，近端小管與遠(yuǎn)端小管的管壁薄厚、管腔大小正常；模型組大鼠腎小球血管球萎縮、腎球囊腔變大，比例失調(diào)，近端小管與遠(yuǎn)端小管的管壁薄厚不勻、管腔大小不一，腫脹，大量的炎性細(xì)胞浸潤，與正常組比較腎臟病理結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，說明糖尿病腎病造膜成功；各給藥組較模型組損傷明顯減緩。2.4.4 腎臟PAS染色 與正常組相比，模型組系膜區(qū)與基質(zhì)發(fā)生明顯增生；與模型組相比，各給藥組的系膜區(qū)與基質(zhì)增生均不明顯，見圖4。

A；正常組；B：模型組；C：高劑量丹蛭降糖膠囊組；D：低劑量丹蛭降糖膠囊組；E：吡格列酮組.圖3 各組大鼠腎臟HE染色后的病理組織學(xué)觀察(×100)

A；正常組；B：模型組；C：高劑量丹蛭降糖膠囊組；D：低劑量丹蛭降糖膠囊組；E：吡格列酮組.圖4 各組大鼠腎臟PAS染色后的病理組織學(xué)觀察(×100)

2.4.5 腎臟MASSON染色 與正常組相比，模型組腎小管、腎小球出現(xiàn)明顯的纖維化；與模型組相比，各給藥組的腎小管、腎小球纖維化均有明顯減輕，見圖5。

3 討論

糖尿病是在遺傳背景基礎(chǔ)上，糖代謝紊亂及其所導(dǎo)致的血流動力學(xué)、細(xì)胞因子、生長因子等多種因素、多系統(tǒng)綜合作用的結(jié)果。糖尿病患者由于血糖長期處于高位，極易誘發(fā)一系列并發(fā)癥，心臟和腎臟是最易發(fā)生病變的臟器。它們都以膠原蛋白基質(zhì)過度累積為特征，尤其是腎臟，腎間質(zhì)纖維化是進(jìn)展到終末期腎功能衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)[7]。

A；正常組；B：模型組；C：高劑量丹蛭降糖膠囊組；D：低劑量丹蛭降糖膠囊組；E：吡格列酮組.圖5 各組大鼠腎臟MASSON染色后的病理組織學(xué)觀察(×100)

本次實(shí)驗(yàn)所采用造模方法為本研究所多次實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，多次小劑量注射STZ既可以避免一次性大劑量STZ帶來的較高的致死率，又可以獲得不低于大劑量注射STZ的高成模率[5]。造模后，模型組大鼠血糖升高，體質(zhì)量下降，攝食攝水量增加，出現(xiàn)糖尿病典型的“三多一少”癥狀，6周后模型組大鼠血糖，血脂水平依然明顯高于正常組，可見本次實(shí)驗(yàn)所用造模方法是穩(wěn)定并可靠的。

丹蛭降糖膠囊中含有太子參、生地、丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭等多種中藥材，丹皮中所含的芍藥苷和氧化芍藥苷能夠有效地抵抗晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)誘導(dǎo)的腎小球細(xì)胞損傷，對腎小球產(chǎn)生保護(hù)作用[8-9]。生地中所含有的有效成分梓醇能夠通過抑制與腎臟纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子-轉(zhuǎn)化生長因子-β1[10](transforming growth factor-β，TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子以及血管緊張素-Ⅱ的表達(dá)減輕了細(xì)胞外基質(zhì)的累積，從而減緩糖尿病對腎臟的損害[11]。此外梓醇還能夠通過抑制NADPH氧化酶對糖尿病患者血管內(nèi)皮功能進(jìn)行保護(hù)[12]。水蛭中所含有的有效成分水蛭素與黃芪聯(lián)用治療鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠兩個月，能顯著降低模型大鼠空腹血糖、24 h蛋白尿量水平以及腎組織中TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而對模型大鼠的腎臟進(jìn)行保護(hù)[13-14]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于正常組，模型組大鼠的攝食量、攝水量、血糖、血脂水平均有明顯的增高，而給予大鼠高低劑量的丹蛭降糖膠囊后，可以發(fā)現(xiàn)，大鼠的攝食量、攝水量、血糖及血脂均得到了有效的改善，有些指標(biāo)甚至好于吡格列酮組。而在可以反映腎功能損傷的4個指標(biāo)中(BUN、Scr、mAlb、尿蛋白量)，與正常組相比，模型組均明顯增加；在給予高低劑量的丹蛭降糖膠囊治療6周后，與模型組相比，4個指標(biāo)雖未降至正常組水平，但均明顯降低。這說明丹蛭降糖膠囊不僅可以有效維持大鼠糖代謝的穩(wěn)定，更可以有效地減輕糖尿病對腎臟帶來的損害，對腎臟起到一定的保護(hù)作用。

本次實(shí)驗(yàn)病理切片亦顯示了與以上分析相同的結(jié)果。與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核增大，形態(tài)不規(guī)則；腎小球血管球萎縮、腎球囊腔變大，比例失調(diào)，近端小管與遠(yuǎn)端小管的管壁薄厚不勻、管腔大小不一，腫脹，大量的炎性細(xì)胞浸潤，腎臟病理結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。給藥6周后，我們發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，高低劑量組的這些病變均有所改善觀察，且系膜區(qū)與基質(zhì)亦沒有發(fā)現(xiàn)明顯的增生，腎小球纖維化程度也有很大程度的減輕。由此，我們可以進(jìn)一步推測，丹蛭降糖膠囊除了具有降低大鼠血糖、血脂水平，緩解多飲、多食癥狀，亦有減輕高血糖對大鼠心臟、腎臟細(xì)胞損害的功效。