一個(gè)家族性高膽固醇血癥家系的基因突變篩查與評(píng)估

張佳虹，張慶英，*，張燕虹，陳甲連，謝 芳，劉銳國(guó)，吳 容，吳龍飛

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；2．云南省玉溪市紅塔區(qū)疾病預(yù)防控制中心慢性病防治科，云南 玉溪653100)

家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H)是一種常見(jiàn)的常染色體遺傳性代謝疾病，其特征是血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的顯著升高，甚至有早發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病和心血管疾病[1]。FH的患病率約為1/250，全世界估計(jì)有1 400萬(wàn)～3 400萬(wàn)名患者[2]。中國(guó)僅有的人群流行病學(xué)調(diào)查來(lái)自江蘇省9 324人的營(yíng)養(yǎng)研究，數(shù)據(jù)顯示FH患病率為0.28%(標(biāo)化率為0.18%)[3]。FH的心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)較高，有研究表明，與無(wú)突變且血脂正常的人相比，無(wú)突變但LDL-C高于4.9 mmol/L的人患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)是前者的6倍，而攜帶FH致病突變且血脂異常的人患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)則高達(dá)22.3倍[4]。DO等對(duì)早發(fā)性心肌梗死患者的研究顯示，約2%患者攜帶FH的基因致病性突變[5]。盡管FH對(duì)心血管系統(tǒng)的危害較大，但全世界FH的診斷率和治療率仍較低，大多數(shù)國(guó)家的診斷率不足1%[2，6]。目前我國(guó)關(guān)于FH的研究仍然較少，其診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，對(duì)于相應(yīng)的遺傳變異情況不明，尚需結(jié)合基因檢測(cè)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，全基因組測(cè)序應(yīng)用于臨床輔助診斷有望實(shí)現(xiàn)[7-8]。FH的早期篩查和診斷有助于患者的早期治療，降低心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)防早死，改善預(yù)后和促進(jìn)康復(fù)。故本研究以一個(gè)臨床診斷的FH家系為調(diào)查對(duì)象，結(jié)合家系成員的臨床指標(biāo)和基因篩查結(jié)果，重點(diǎn)對(duì)LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1這4個(gè)公認(rèn)的與FH相關(guān)的基因進(jìn)行篩查，并進(jìn)行生物信息學(xué)的SNP功能預(yù)測(cè)，以尋找該家系的致病基因，為其維持合適的血脂水平和促進(jìn)健康提供指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象來(lái)源于云南省玉溪市某社區(qū)流行病學(xué)項(xiàng)目篩查發(fā)現(xiàn)的血脂異常的高膽固醇血癥患者，選取其中1名總膽固醇(total cholesterol，TC)達(dá)8.71 mmol/L的患者為研究對(duì)象，進(jìn)一步篩查其家庭成員的血脂情況。根據(jù)《中國(guó)成人血脂異常防治指南》[9]，美國(guó)國(guó)家脂質(zhì)協(xié)會(huì)血脂異常治療指南建議[10]、陳在嘉主編的《臨床冠心病學(xué)》[11]綜合考量，制定FH診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]：接受調(diào)脂藥物治療的患者血清TC水平≥6.22 mmol/L，未接受調(diào)脂藥物治療的患者血清TC水平≥7.8 mmol/L，同時(shí)至少具有下列特征之一：①患者本人或其直系親屬中有肌腱黃色瘤者；②患者直系親屬中有高膽固醇血癥者；③患者家庭成員中有兒童期就被檢出有高膽固醇血癥者。

根據(jù)篩查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該家系有2名成員符合FH診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此將所有家庭成員同時(shí)納入進(jìn)行進(jìn)一步的基因檢測(cè)，并繪制家系圖，Ⅰ表示第一代人，Ⅱ表示第二代人，每一代成員序號(hào)則從左往右由1開始依次編號(hào)。

1.2 血樣采集

在取得調(diào)查對(duì)象知情同意后，受試者禁食后于清晨空腹采集外周靜脈血，送玉溪市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)總膽固醇、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)4項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.3 全基因組外顯子測(cè)序

將采集的血液送華大基因，提取白細(xì)胞DNA進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)進(jìn)行序列比對(duì)，SOAPsnp，SAMtools或GATK軟件進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)檢測(cè)。AnnoDB用于注釋SNP。質(zhì)量控制貫穿整個(gè)數(shù)據(jù)處理的過(guò)程。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究重點(diǎn)對(duì)4個(gè)公認(rèn)的FH致病基因LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(https://sift.bii.a-star.edu.sg/)這兩個(gè)常用的具有代表性的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行功能和保守性危害預(yù)測(cè)。PolyPhen-2考慮了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和比較進(jìn)化，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)預(yù)測(cè)氨基酸替換對(duì)人類蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功能的可能影響[13]，并作定性評(píng)價(jià)：得分0.909～1.000為很可能致病，0.447～0.908為可能致病，0～0.446為良性。SIFT則基于氨基酸保守程度，通過(guò)與近似的序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算堿基發(fā)生替換的概率，對(duì)引起氨基酸改變的非同義的SNP進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，得分≤0.05提示有害，＞0.05提示可容忍。

2 結(jié)果

2.1 血脂情況和家系情況

據(jù)調(diào)查，該家系4名成員均未發(fā)現(xiàn)肌腱黃色瘤，均未服用調(diào)脂藥物。家系圖和成員編號(hào)見(jiàn)圖1。成員Ⅰ-1的血清TC達(dá)8.71 mmol/L，其兒子為高膽固醇血癥者，故Ⅰ-1符合FH診斷標(biāo)準(zhǔn)。成員Ⅱ-1的血清TC達(dá)8.05 mmol/L，其母親為高膽固醇血癥者，故Ⅱ-1也符合FH診斷標(biāo)準(zhǔn)。該家系有Ⅰ-1和Ⅱ-1這2名成員患FH，具體情況見(jiàn)表1。

圖1 FH家系圖

表1 FH家系成員血脂情況

2.2 測(cè)序結(jié)果和危害分析

該家系中共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNP位點(diǎn)，分別位于APOB，PCSK9和LDLRAP1基因上，位點(diǎn)情況詳見(jiàn)表2。經(jīng)Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)，APOB基因上2個(gè)SNP位點(diǎn)rs676210和rs679899得分分別為0.999和0.998，均提示很可能致?。?個(gè)新位點(diǎn)c.10094A＞T和c.9937C＞G得分分別為0.829和0.770，均提示可能致病。上述4個(gè)位點(diǎn)經(jīng)SIFT軟件預(yù)測(cè)均為有害的。APOB基因的其他位點(diǎn)、PCSK9和LDLRAP1基因上的位點(diǎn)均被預(yù)測(cè)為良性。未發(fā)現(xiàn)LDLR基因的SNP位點(diǎn)。

該家系中2名患者和2名未患病者均攜帶rs676210和rs679899位點(diǎn)，另有未患病者Ⅰ-2攜帶兩個(gè)新位點(diǎn)c.10094A＞T和c.9937C＞G，說(shuō)明這些位點(diǎn)均不與疾病表型共分離。

表2 家族性高膽固醇血癥家系的APOB、PCSK9、LDLRAP1基因SNP位點(diǎn)情況

3 討論

本研究通過(guò)社區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)FH家系，重點(diǎn)對(duì)LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1基因進(jìn)行篩查后發(fā)現(xiàn)了APOB基因上4個(gè)可能與血脂增高有關(guān)的SNP位點(diǎn)，其中rs676210和rs679899為前人報(bào)道過(guò)的與血脂相關(guān)的位點(diǎn)，c.10094A＞T和c.9937C＞G為本研究發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)，但在該家系中這些SNP位點(diǎn)均不與疾病表型共分離，這些位點(diǎn)的功能還有待進(jìn)一步探討。

FH的分子遺傳機(jī)制復(fù)雜，目前至少已發(fā)現(xiàn)9個(gè)致病基因上千個(gè)致病位點(diǎn)，包括LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1、APOE、STAP1、LIPA、ABCG5和ABCG8基因[7]。遺傳圖譜和下一代測(cè)序結(jié)果表明在雜合子FH患者中，80%～85%存在LDLR基因變異，5%～10%存在APOB基因變異，PCSK9和LDLRAP1貢獻(xiàn)的比例均不到1%[7]。目前，國(guó)內(nèi)FH診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是檢測(cè)到LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1基因的致病性突變[14]，但也有許多患者達(dá)到了臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但卻未發(fā)現(xiàn)致病突變[15-16]。因此專家建議更準(zhǔn)確的FH診斷需結(jié)合臨床診斷和基因檢測(cè)結(jié)果[14]。而臨床診斷和基因診斷不一致的患者心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)依舊相當(dāng)高，仍然需要我們持續(xù)關(guān)注。

APOB基因位于人2號(hào)染色體的短臂上(2p24.1)，有29個(gè)外顯子。APOB是乳糜微粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和脂蛋白a的載體蛋白，主要以兩種亞型存在：小腸合成的ApoB48和肝臟合成的ApoB100[17]。每個(gè)LDL顆粒上都有一個(gè)ApoB100分子，用于結(jié)合LDL受體，在LDLR的介導(dǎo)下發(fā)生內(nèi)吞作用，進(jìn)入肝臟代謝，從而清除血液中的LDL-C。APOB基因在脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，而該基因突變引起血清APOB升高，可能會(huì)導(dǎo)致LDL-C升高和其他脂代謝紊亂、及在正常的LDL-C水平下使冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加[7]。

此前Gu等對(duì)631名中國(guó)裕固族居民的研究顯示，與TT突變基因型相比，APOB基因SNP位點(diǎn)rs676210的CT和CT+CC基因型居民患高血脂的風(fēng)險(xiǎn)分別是1.72倍和1.67倍，攜帶C等位基因的人可能更易患高脂血癥，該位點(diǎn)可能成為裕固族中老年人群高脂血癥篩查的新位點(diǎn)；而在該人群中rs679899不同基因型對(duì)血脂的影響未見(jiàn)差別[18]。WOJCZYNSKI等對(duì)958人采用非諾貝特治療后發(fā)現(xiàn)，rs676210 CC、CT和TT基因型的TG水平分別降低了24.7%、28.3%和34.5%，該位點(diǎn)可能有助于識(shí)別對(duì)非諾貝特降脂治療敏感的患者[19]。另一項(xiàng)采用遺傳易感性評(píng)分的病例對(duì)照研究顯示，冠心病患者rs679899各基因型分布有差異，且T等位基因出現(xiàn)的頻率比對(duì)照組高[20]。BENN等對(duì)哥本哈根心臟隊(duì)列研究9185人基因分型結(jié)果顯示，與野生基因型相比，rs676210和rs679899位點(diǎn)雜合基因型的血漿LDL-C分別降低了0.14和0.12 mmol/L，rs679899位點(diǎn)純合突變型的LDL-C降低了0.18 mmol/L[21]。rs676210所在的區(qū)域參與VLDL轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)DL過(guò)程中ApoB的結(jié)構(gòu)變化過(guò)程[22]，而rs679899則位于調(diào)控新生ApoB脂質(zhì)化的關(guān)鍵區(qū) 域[23]，二者在ApoB的形成和生物學(xué)功能發(fā)揮過(guò)程中都起著重要作用，值得我們進(jìn)一步地探究。而兩個(gè)新位點(diǎn)c.10094A＞T和c.9937C＞G是否在血脂代謝過(guò)程中發(fā)揮生物學(xué)作用，還需進(jìn)一步的人群研究和功能實(shí)驗(yàn)來(lái)佐證。

本研究未發(fā)現(xiàn)PCSK9和LDLRAP1基因上的有害變異。PCSK9和LDLRAP1基因突變通常與家族性高膽固醇血癥有關(guān)。研究表明PCSK9通過(guò)誘導(dǎo)LDL受體(LDLR)的降解來(lái)參與脂質(zhì)代謝，使血液中LDL-C水平升高[24]。PCSK9功能獲得型突變通常引起膽固醇升高，臨床上PCSK9抑制劑多與他汀類聯(lián)合用藥來(lái)控制血脂[25]。LDLRAP1基因編碼的蛋白通常與LDLR蛋白結(jié)合，參與LDL的內(nèi)化、LDLR的循環(huán)利用或降解過(guò)程[7]。

目前，F(xiàn)H有1 097個(gè)致病或可能致病位點(diǎn)，但85%的位點(diǎn)體外功能研究證據(jù)缺乏[26]，新位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和功能研究是闡明潛在的生物學(xué)機(jī)制和藥物作用靶點(diǎn)的關(guān)鍵，對(duì)FH患者的篩查識(shí)別和預(yù)后也至關(guān)重要[26-27]。因此，建議有條件的疑似或臨床診斷FH患者進(jìn)行基因檢測(cè)，做到早發(fā)現(xiàn)早治療。本研究也存在一定的局限性，如僅針對(duì)一個(gè)家系進(jìn)行研究，未檢測(cè)血液APOB水平，未進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等，后續(xù)還需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，增加檢測(cè)指標(biāo)，從多方面驗(yàn)證SNP與疾病的關(guān)系。