大鼠多器官彗星試驗(yàn)方法的驗(yàn)證研究

周長(zhǎng)慧，韓天嬌，黃鵬程，馬 璟，常 艷

(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院/上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203)

體內(nèi)彗星試驗(yàn)近幾年來(lái)受到廣泛關(guān)注，國(guó)際上多個(gè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)如食品化學(xué)誘變委員會(huì)、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)價(jià)和研究中心、歐洲食品安全局、人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)和歐洲醫(yī)藥管理局推薦應(yīng)用體內(nèi)彗星試驗(yàn)對(duì)體內(nèi)或體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行追加補(bǔ)充。其中人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(International Council for Harmonization，ICH)已于2011年將體內(nèi)肝臟彗星試驗(yàn)列入S2R1指導(dǎo)原則中，將其作為體內(nèi)試驗(yàn)第2個(gè)首選終點(diǎn)[1]。但一項(xiàng)試驗(yàn)投入正式應(yīng)用之前需要經(jīng)過(guò)大量的驗(yàn)證，因此2006年由日本替代方法驗(yàn)證中心牽頭，與美國(guó)國(guó)家替代毒性試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)中心、歐洲替代方法驗(yàn)證中心和日本環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)/哺乳動(dòng)物致突變性研究組共同組織彗星試驗(yàn)的聯(lián)合驗(yàn)證，該驗(yàn)證的成功完成為制定標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方案和OECD試驗(yàn)指導(dǎo)原則打下了基礎(chǔ)[2]。2014年OECD體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)指導(dǎo)原則TG489發(fā)表[3]。

彗星試驗(yàn)具有如下優(yōu)點(diǎn)[4]：①該試驗(yàn)測(cè)定的是單個(gè)細(xì)胞水平的DNA損傷，故敏感性相對(duì)較高；能夠測(cè)定多種感興趣的組織或器官的遺傳毒性[5-7]；②進(jìn)行分析所需的細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少；③檢測(cè)譜較寬，能夠測(cè)定如DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂及堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)等在內(nèi)的DNA損傷[8]；④試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果采集可在試驗(yàn)結(jié)束隔日進(jìn)行，數(shù)據(jù)的收集過(guò)程較短；⑤該試驗(yàn)耗時(shí)相對(duì)較短，并且試驗(yàn)成本相對(duì)較低。

相比國(guó)外對(duì)體內(nèi)彗星試驗(yàn)的廣泛研究，國(guó)內(nèi)對(duì)該項(xiàng)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化研究相對(duì)較少。本研究旨在采用多個(gè)不同作用機(jī)制的化合物(1個(gè)遺傳毒性化合物對(duì)氯苯胺、1個(gè)非遺傳毒性化合物氯化鈉、1個(gè)肝毒性化合物對(duì)乙酰氨基酚、1個(gè)腎毒性化合物慶大霉素)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室前期建立的大鼠體內(nèi)多器官(肝、胃和腎)的堿性彗星試驗(yàn)方法[9]，研究靶器官毒性化合物因細(xì)胞毒性可能對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果的影響，擬為國(guó)內(nèi)多個(gè)GLP實(shí)驗(yàn)室對(duì)該方法的聯(lián)合驗(yàn)證提供技術(shù)支撐，也有望為該方法在新藥遺傳毒性評(píng)價(jià)領(lǐng)域的推廣提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

對(duì)氯苯胺、氯化鈉、對(duì)乙酰氨基酚、甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)，均購(gòu)于Sigma公司；慶大霉素，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Comet Assay?試劑盒、電泳儀，均購(gòu)于美國(guó)Trevigen公司，SYBR?Gold染液購(gòu)自加拿大Invitrogen公司，40μm孔徑微孔濾膜為美國(guó)BD Falcon；X51型顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 動(dòng)物、分組處理和取材

每個(gè)受試物使用SPF級(jí)雄性SD大鼠25只，7～9周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在溫度20～26℃、濕度40%～70%、12 h/12 h明暗周期的飼養(yǎng)室，每籠飼養(yǎng)5只大鼠，用SPF大小鼠維持飼料，自由進(jìn)食和飲水。每天給予受試物之前，EMS采用生理鹽水稀釋至20 mg/mL，慶大霉素采用生理鹽水稀釋至80、40和20 mg/mL，氯化鈉采用去離子水配制成至50、100和200 mg/mL，對(duì)乙酰氨基酚采用0.5%CMC-Na重懸至2、10和50 mg/mL，對(duì)氯苯胺采用玉米油重懸至3.75、7.5和15 mg/mL。除慶大霉素肌肉注射外，其他均經(jīng)口灌胃給予受試物，體積為10 mL/kg。

每個(gè)受試物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)1周后，隨機(jī)分成5組，每組5只動(dòng)物，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量受試物組。受試物和溶劑對(duì)照品分別在第1天、第2天(約24 h后)和第3天(約21 h后)給予動(dòng)物，陽(yáng)性對(duì)照品(EMS)僅給藥2 d(第2和第3天)。每天給予受試物前稱體質(zhì)量，在最后一次給予受試物約3 h后，動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥鈉(30～45 mg/kg)麻醉放血安樂(lè)死后進(jìn)行肝臟、胃和腎臟的組織取樣。

1.3 單細(xì)胞懸液制備和制片

將胃沿胃大彎剪開(kāi)，用冷的無(wú)鈣鎂的PBS清洗胃部；用冷的剪切緩沖液[將20 mmol/L EDTA-Na2溶于一定量的Hank’s緩沖液(無(wú)鈣、鎂和苯酚)中，待充分溶解后，應(yīng)用5 mol/L氫氧化鈉溶液和6 mol/L鹽酸溶液將溶液pH值調(diào)至7.5，并將溶液置于2～8℃冰箱中保存以備用，在用前加入10%DMSO]清洗胃，棄去前胃部分，腺胃浸于現(xiàn)配冷的剪切緩沖液15～30 min；胃表面上皮用塑料刮板刮幾次后用冷的剪切緩沖液充分沖洗；用不銹鋼輕輕刮胃黏膜5～10次以釋放細(xì)胞；用3 mL剪切緩沖液將刮下的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，輕輕吹打約15次，經(jīng)40μm濾膜過(guò)篩得上清液用于制片。

取每只動(dòng)物的肝左葉中間部分，用冷的剪切緩沖液沖洗，其中僅對(duì)乙酰氨基酚實(shí)驗(yàn)中剩下的肝左葉部分用10%福爾馬林固定用于病理檢查。取每只動(dòng)物的一個(gè)腎臟進(jìn)行彗星試驗(yàn)，先將腎臟表面一層膜棄去，沿皮質(zhì)大彎中心處剪掉約5 mm3的組織。其中僅慶大霉素實(shí)驗(yàn)中彗星取材剩余的腎臟和另一個(gè)腎臟將用10%的福爾馬林固定用于病理檢查。取下的新鮮肝組織和腎臟用剪刀剪碎以釋放細(xì)胞，經(jīng)40μm濾膜過(guò)篩得上清液用于制片。

用冷的剪切緩沖液將肝、胃和腎細(xì)胞濃度調(diào)至(2.0～4.0)×105個(gè)/mL。取上述制備好的肝臟單細(xì)胞懸液與0.5%低熔點(diǎn)膠混合加樣于彗星玻片的孔中。每只動(dòng)物至少平行制片2孔，同一動(dòng)物的平行樣品不在同一張玻片上。

1.4 裂解、解旋、電泳和分析

將制備完成的玻片浸入裂解液中，置于2～8℃冰箱避光過(guò)夜裂解。然后將其置于堿性解旋液中解旋后，采用Trevigen電泳系統(tǒng)進(jìn)行電泳(保持電泳的電壓為0.7 V/cm，電流約為300 mA)。電泳后，玻片經(jīng)中和、干燥后室溫保存待分析。玻片經(jīng)SYBR Gold?染液染色后，采用連接彗星顯像分析系統(tǒng)(Comet Assay IV)的熒光顯微鏡閱片分析。每只動(dòng)物分析150個(gè)細(xì)胞(即每孔75個(gè)細(xì)胞)的尾部DNA百分率，并記錄期間的刺猬細(xì)胞(頭小、尾巴大、分布松散的細(xì)胞)數(shù)目。

1.5 數(shù)據(jù)分析

計(jì)數(shù)參與彗星試驗(yàn)的動(dòng)物肝、胃和腎細(xì)胞每孔尾部DNA百分率的中位數(shù)和平均數(shù)，并計(jì)算每只動(dòng)物兩孔或多孔尾部DNA百分率的中位數(shù)和平均數(shù)的均值，結(jié)果以表示。

受試物各劑量組的尾部DNA百分率均分別與各自溶劑對(duì)照組的尾部DNA百分率性別區(qū)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，采用如下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：①用Levene's檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的方差齊性，如方差齊，則進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；當(dāng)方差不齊，則采用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較(0.05和0.01水平)。②當(dāng)方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步用Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；當(dāng)方差分析結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。陽(yáng)性對(duì)照組的尾部DNA百分率與溶劑對(duì)照組的尾部DNA百分率性別區(qū)分比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未見(jiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物。對(duì)氯苯胺≥37.5 mg/kg劑量組動(dòng)物出現(xiàn)四肢顏色發(fā)暗發(fā)涼；≥75 mg/kg劑量組動(dòng)物還可見(jiàn)眼周分泌污染物；150 mg/kg劑量組動(dòng)物的活動(dòng)度減少。對(duì)乙酰氨基酚500 mg/kg組個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)度減少外，其余動(dòng)物均未見(jiàn)其他明顯異常。氯化鈉和慶大霉素各劑量組動(dòng)物未見(jiàn)明顯異常的臨床癥狀。

2.2 組織病理學(xué)檢查

本研究對(duì)肝毒性化合物對(duì)乙酰氨基酚處理組動(dòng)物的肝臟和腎毒性化合物慶大霉素處理組動(dòng)物的腎臟進(jìn)行了病理結(jié)果分析。其中，對(duì)乙酰氨基酚20 mg/kg處理組有1只動(dòng)物肝臟出現(xiàn)輕微的單細(xì)胞炎癥反應(yīng)；100 mg/kg處理組有2只動(dòng)物出現(xiàn)輕度局灶性炎癥、單細(xì)胞壞死；500 mg/kg處理組有4只動(dòng)物肝臟出現(xiàn)單細(xì)胞炎癥、壞死腫脹等病理變化。圖1和圖2分別為100和500 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚引起的肝臟病理變化。慶大霉素由于劑型限制，在最大可行處理劑量80 mg/kg水平下腎臟組織病理學(xué)未見(jiàn)改變。

圖1 100 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚處理組大鼠的肝臟組織病理學(xué)改變

圖2 500 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚處理組大鼠的肝臟組織病理學(xué)改變

2.3 彗星試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)氯苯胺37.5 mg/kg組動(dòng)物肝、胃和腎的尾部DNA百分率均值(即中位數(shù)的均值)與溶劑對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，75和150 mg/kg組產(chǎn)生的尾部DNA百分率均值與溶劑對(duì)照組相比均增加(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

氯化鈉的劑量高至2 000 mg/kg，其肝、胃和腎的尾部DNA百分率均值與溶劑對(duì)照組相比差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，見(jiàn)表2。

對(duì)乙酰氨基酚的3個(gè)劑量組與溶劑對(duì)照組相比，大鼠肝、胃和腎的尾部DNA百分率均未出現(xiàn)顯著性增加，但中劑量(100 mg/kg)組動(dòng)物的胃和腎臟分別出現(xiàn)1個(gè)和4個(gè)刺猬細(xì)胞，高劑量(500 mg/kg)組動(dòng)物肝臟、胃和腎臟分別出現(xiàn)了4個(gè)、1個(gè)和7個(gè)刺猬細(xì)胞；陽(yáng)性對(duì)照EMS組大鼠肝臟、胃和腎臟分別出現(xiàn)了5、13和10個(gè)刺猬細(xì)胞，見(jiàn)表3。

表1 對(duì)氯苯胺處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表1 對(duì)氯苯胺處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對(duì)照組相比，*P＜0.01.

組別溶劑對(duì)照組對(duì)氯苯胺37.5 mg/kg 75 mg/kg 150 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組(EMS)肝0.31±0.56 2.28±1.82 11.38±2.19*13.45±2.82*16.65±1.51*胃0.68±0.36 2.4±1.93 10.3±7.84*11.5±3.26*22.10±2.55*腎1.17±0.63 1.18±1.71 10.11±4.54*14.23±6.48*22.17±4.01*?

表2 氯化鈉處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表2 氯化鈉處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對(duì)照組相比，*P＜0.01.

組別溶劑對(duì)照組氯化鈉500 mg/kg 1 000 mg/kg 2 000 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組(EMS)肝0.92±0.64 0.09±0.05 0.33±0.37 0.14±0.19 13.25±1.75*胃0.92±0.61 0.72±0.41 0.35±0.31 0.79±0.39 18.46±0.39*腎0.39±0.27 0.21±0.21 0.86±0.77 0.46±0.28 11.62±1.64*

表3 對(duì)乙酰氨基酚處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率和刺猬細(xì)胞數(shù)

慶大霉素的3個(gè)劑量組與溶劑對(duì)照組相比，肝、胃和腎的尾部DNA百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 慶大霉素處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

表4 慶大霉素處理組大鼠肝臟、胃和腎臟的尾部DNA百分率(%，)

與溶劑對(duì)照組相比，*P＜0.01.

3 討論

對(duì)氯苯胺的Ames試驗(yàn)和體外染色體斷裂試驗(yàn)呈陽(yáng)性，小鼠體內(nèi)微核試驗(yàn)呈陽(yáng)性且小鼠多個(gè)靶器官的彗星試驗(yàn)結(jié)果也呈陽(yáng)性[10]，因此應(yīng)用對(duì)氯苯胺進(jìn)行大鼠體內(nèi)彗星試驗(yàn)的驗(yàn)證。對(duì)氯苯胺的彗星試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，灌胃給予受試物3次，75和150 mg/kg處理組大鼠肝臟、胃的尾部DNA百分率與陰性對(duì)照組相比明顯增加，該試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證結(jié)果相符[11]；75和150 mg/kg處理組大鼠腎臟尾部DNA百分率與陰性對(duì)照組相比明顯增加，且無(wú)該化合物腎臟靶器官的相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)氯苯胺的大鼠體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。

氯化鈉是已知的非遺傳毒性化合物，常作為試驗(yàn)溶劑。本試驗(yàn)中，參考聯(lián)合驗(yàn)證的劑量(2 000、1 000和500 mg/kg)，結(jié)果顯示3個(gè)劑量組的尾部DNA百分率與陰性對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與彗星聯(lián)合驗(yàn)證結(jié)果一致。因此，氯化鈉的彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

刺猬細(xì)胞是在形態(tài)上“頭很小但尾巴很大分布很散”的細(xì)胞[12]，目前國(guó)際上對(duì)刺猬細(xì)胞作為遺傳毒性或細(xì)胞毒性的標(biāo)志出現(xiàn)分歧，當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)了刺猬細(xì)胞或彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)需要判斷是否細(xì)胞毒性對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因?yàn)榫哂刑囟ò衅鞴俣拘曰衔锏募?xì)胞毒性可能對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果評(píng)判有影響，IWGT建議應(yīng)采用評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的金標(biāo)準(zhǔn)——病理檢查進(jìn)行排除[13-14]。

對(duì)乙酰氨基酚是已知的肝毒性化合物，文獻(xiàn)報(bào)道[15]對(duì)乙酰氨基酚在625 mg/kg劑量水平下，作用6和12 h后，大鼠出現(xiàn)明顯的肝臟組織病理學(xué)改變，故本課題乙酰氨基酚的低、中和高劑量分別設(shè)置為20、100和500 mg/kg。具有肝臟毒性的對(duì)乙酰氨基酚各劑量組均出現(xiàn)了刺猬細(xì)胞，病理結(jié)果顯示100和500 mg/kg劑量組都出現(xiàn)了不同程度的肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死等變化。但對(duì)乙酰氨基酚各個(gè)劑量3個(gè)組織器官的尾部DNA百分率與陰性對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在乙酰氨基酚的彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

由于劑型的限制，慶大霉素注射液的最大劑量為80 mg/kg，有文獻(xiàn)報(bào)道[16]該劑量的慶大霉素在處理7和14 d，大鼠腎臟出現(xiàn)明顯的病理改變(如明顯局灶性腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、局灶性腎小管嗜堿性變、不同程度眼形細(xì)胞浸潤(rùn)和局灶性腎小管擴(kuò)張等)。但在該劑量下，肌肉注射慶大霉素3 d，腎臟病理學(xué)沒(méi)有改變；慶大霉素20、40和80 mg/kg各劑量組尾部DNA百分率與陰性對(duì)照組相比并無(wú)顯著性增加，因此在本試驗(yàn)條件下慶大霉素注射液的彗星試驗(yàn)呈陰性。

考慮到這4種化合物的組織特異性和作用方式，本研究通過(guò)應(yīng)用不同機(jī)制的化合物對(duì)體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。其中對(duì)氯苯胺的彗星結(jié)果呈陽(yáng)性，氯化鈉、對(duì)乙酰氨基酚和慶大霉素的彗星結(jié)果呈陰性，結(jié)果與預(yù)期一致，證明了該試驗(yàn)方法具有較好的靈敏度和特異性。本研究中使用3 d給藥試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以很容易地將細(xì)胞遺傳學(xué)損傷和DNA損傷終點(diǎn)整合到一項(xiàng)研究中。與國(guó)際彗星試驗(yàn)聯(lián)合驗(yàn)證相比，增加了腎臟DNA損傷的評(píng)價(jià)，并研究化合物產(chǎn)生靶器官毒性的同時(shí)是否能夠引起DNA損傷，可為國(guó)內(nèi)機(jī)構(gòu)的聯(lián)合驗(yàn)證提供技術(shù)支持。綜上所述，體內(nèi)多器官彗星檢測(cè)是檢測(cè)一系列DNA損傷劑的有效方法，具有廣泛的適用性。