不同焦油釋放量卷煙全煙氣氣-液界面暴露致細(xì)胞毒性、炎癥因子釋放和細(xì)胞凋亡的研究

華辰鳳，趙俊偉，尚平平，樊美娟，謝復(fù)煒，李 翔*

(中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州 450001)

卷煙煙氣是一種由氣相部分和粒相部分組成的復(fù)雜氣溶膠。其中，氣相物質(zhì)占92%，粒相物質(zhì)占8%。據(jù)報(bào)道，已確定的煙氣成分有近5 000多種，其中國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列出卷煙煙氣中可以致癌化合物69種[1]，公共衛(wèi)生組織認(rèn)為可能導(dǎo)致煙草相關(guān)疾病的煙氣成分100多種。目前，對卷煙煙氣體外毒性評價(jià)研究多采用煙氣中單一成分如4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮[4-(N-nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)butan-1-one，NNK][2]、苯并[a]芘、鎘等[3]或煙氣總粒相物進(jìn)行檢測和研究[4-5]，不符合人體吸煙時(shí)的正常生理過程，難以全面真實(shí)地反映煙氣混合物體系的生物學(xué)效應(yīng)。全煙氣氣-液界面系統(tǒng)是一種集細(xì)胞氣-液界面培養(yǎng)和卷煙主流煙氣暴露為一體的煙氣以氣溶膠形式直接暴露細(xì)胞的系統(tǒng)，具體是利用多孔膜細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將細(xì)胞培養(yǎng)于微孔膜層，并以微孔膜為分界線，使生長于該膜上的細(xì)胞處于上方為氣體、下方為液體的環(huán)境；且將吸煙機(jī)產(chǎn)生的主流煙氣直接傳送至該系統(tǒng)的細(xì)胞氣-液界面的氣體層，以實(shí)現(xiàn)卷煙煙氣(包括粒相成分和氣相成分)對人呼吸系統(tǒng)細(xì)胞暴露的實(shí)際狀況模擬，具有可以實(shí)時(shí)、全面反映卷煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)[6-7]。由于吸煙直接暴露作用靶點(diǎn)是人呼吸系統(tǒng)，本研究選用人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2b這種被廣泛用于體外研究與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)研究的細(xì)胞模型，利用全煙氣氣-液界面系統(tǒng)暴露染毒Beas-2b細(xì)胞模擬人體肺支氣管暴露煙氣環(huán)境，探討兩種焦油釋放量卷煙對Beas-2b細(xì)胞引起的細(xì)胞毒性、炎癥因子釋放水平和細(xì)胞凋亡情況，初步比較不同焦油釋放量卷煙對細(xì)胞的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和受試物

Beas-2b購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)；國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization，ISO)規(guī)定抽吸方式下焦油釋放量分別為每支9.4 mg的卷煙樣品1和每支14.0 mg的卷煙樣品2。

1.2 主要試劑和儀器

Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKitTM(BEGMTM)購自美國Lonza公司；中性紅染料購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；人CXCL8/IL-8、CXCL6/IL-6 Quantikine ELISA試劑盒購自美國R&D公司。SWCJ-2FD超凈工作臺購自江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；10 cm培養(yǎng)皿、96孔板、12 mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Transwell)均購自美國Corning Costar公司；SpectraMax 190酶標(biāo)儀購自美國MD公司；VITROCELL?系統(tǒng)購自德國Vitrocell公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

處于指數(shù)期的Beas-2b細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室，每個(gè)小室1×105個(gè)細(xì)胞，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下于BEGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行煙氣暴露實(shí)驗(yàn)。

1.4 全煙氣暴露染毒

使用VITROCELL系統(tǒng)進(jìn)行卷煙全煙氣氣-液界面暴露實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)由VC10吸煙機(jī)、煙氣稀釋系統(tǒng)和煙氣暴露裝置組成。移除Transwell小室內(nèi)液體，將小室置于煙氣暴露裝置中，每個(gè)煙氣暴露裝置中置3個(gè)小室。卷煙于ISO規(guī)定抽吸參數(shù)下抽吸(相關(guān)參數(shù)見表1)，吸煙機(jī)抽吸產(chǎn)生的主流煙氣分別與不同流速的潔凈空氣(7.50、3.00、1.00、0.25 L/min)混合稀釋后以恒定流速進(jìn)入煙氣暴露裝置中，每個(gè)染毒組抽吸2支卷煙；卷煙對照組細(xì)胞暴露于潔凈空氣中。Transwell小室微孔膜上層為煙氣或潔凈空氣環(huán)境，下層為培養(yǎng)液，生長在微孔膜上的細(xì)胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙煙氣或潔凈空氣中暴露培養(yǎng)；煙氣劑量以進(jìn)入到煙氣暴露裝置中的卷煙主流煙氣占產(chǎn)生的卷煙主流煙氣的百分比表示(單位為支)，按下列公式[8]計(jì)算后，則潔凈空氣對照組染毒劑量為0支，處理組煙氣劑量分別為0.12%支、0.27%支、0.57%支、1%支。

表1 全煙氣暴露染毒相關(guān)參數(shù)

1.5 指標(biāo)檢測

全煙氣暴露結(jié)束后，將Transwell小室轉(zhuǎn)入12孔板中，每小室補(bǔ)0.5 mL培養(yǎng)基后，各組Beas-2b細(xì)胞于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。吸去培養(yǎng)液，PBS洗一次，中性紅試驗(yàn)按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測細(xì)胞毒性。使用GraphPad Prism軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，試驗(yàn)按照人CXCL6/IL-6 Quantikine ELISA、人CXCL8/IL-8 Quantikine ELISA試劑盒提供步驟檢測IL-6、IL-8水平。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提供的步驟檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 樣品卷煙全煙氣氣-液界面暴露對細(xì)胞存活率的影響

用卷煙樣品1和樣品2全煙氣氣-液界面暴露染毒Beas-2b細(xì)胞時(shí)，兩種卷煙煙氣對Beas-2b細(xì)胞的存活均有抑制作用且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖1)，即隨著染毒煙氣劑量的不斷增加，細(xì)胞存活率不斷降低(P＜0.05)，其中樣品1和樣品2的卷煙煙氣對Beas-2b細(xì)胞存活率的IC50值分別為(0.89±0.10)%支和(0.52±0.05)%支。且在相同0.57%支和1%支的煙氣劑量下，樣品2卷煙煙氣染毒后的Beas-2b細(xì)胞存活率低于樣品1卷煙煙氣染毒的細(xì)胞存活率(P＜0.05)；在相同0.12%支和0.27%支的煙氣劑量下，樣品2卷煙煙氣染毒后的Beas-2b細(xì)胞存活率與樣品1卷煙煙氣染毒細(xì)胞存活率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

樣品1卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，*P＜0.05；樣品2卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，#P＜0.05；樣品2卷煙煙氣染毒組與樣品1卷煙煙氣染毒組相比，&P＜0.05.圖1 樣品1和樣品2卷煙煙氣對Beas-2b細(xì)胞存活率的影響

2.2 樣品卷煙全煙氣氣-液界面暴露對Beas-2b細(xì)胞IL-6、IL-8釋放水平的影響

由2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取樣品1和樣品2卷煙煙氣引起B(yǎng)eas-2b細(xì)胞85%細(xì)胞存活的染毒劑量對Beas-2b細(xì)胞進(jìn)行全煙氣氣-液界面暴露，研究兩種卷煙樣品煙氣對Beas-2b細(xì)胞IL-6、IL-8釋放水平的影響。即樣品1、樣品2煙氣暴露劑量均為0.12%支。ELISA法檢測IL-6、IL-8表達(dá)水平結(jié)果見圖2，與潔凈空氣對照組相比，樣品1、樣品2煙氣暴露劑量在0.12%支時(shí)，IL-6、IL-8釋放水平顯著增加(P＜0.05)；且在相同0.12%支煙氣劑量下，樣品2與樣品1卷煙煙氣引起的IL-6、IL-8炎癥釋放水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

A：各組Beas-2b細(xì)胞IL-6釋放水平；B：各組Beas-2b細(xì)胞IL-8釋放水平.樣品1卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，*P＜0.05；樣品2卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，#P＜0.05.圖2 樣品1和樣品2卷煙煙氣對Beas-2b細(xì)胞IL-6、IL-8釋放水平的影響

2.3 樣品卷煙全煙氣氣-液界面暴露對Beas-2b細(xì)胞凋亡的影響

由2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取樣品1和樣品2卷煙煙氣引起B(yǎng)eas-2b細(xì)胞85%細(xì)胞存活的染毒劑量對Beas-2b細(xì)胞進(jìn)行全煙氣氣-液界面暴露，研究兩種卷煙樣品煙氣對Beas-2b細(xì)胞凋亡的影響。即樣品1、樣品2煙氣暴露劑量均為0.12%支。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞凋亡水平結(jié)果見圖3，與對應(yīng)潔凈空氣對照組相比，樣品1、樣品2煙氣暴露劑量在0.12%支時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)；且在相同0.12%支煙氣劑量下，樣品2與樣品1引起的細(xì)胞凋亡率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測潔凈空氣對照組Beas-2b細(xì)胞凋亡情況的散點(diǎn)圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測樣品1卷煙煙氣染毒組Beas-2b細(xì)胞凋亡情況的散點(diǎn)圖；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測樣品2卷煙煙氣染毒組Beas-2b細(xì)胞凋亡情況的散點(diǎn)圖；D：各組Beas-2b細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析.樣品1卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，*P＜0.05；樣品2卷煙煙氣染毒組與潔凈空氣對照組相比，#P＜0.05.圖3 樣品1和樣品2卷煙煙氣對Beas-2b細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

呼吸道受到外界刺激時(shí)，可引起呼吸道細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡和炎癥因子如IL-6、IL-8等分泌參與自身免疫、炎癥過程[4]。本研究中，利用VITROCELL氣-液界面暴露系統(tǒng)將人支氣管上皮細(xì)胞Beas-2b暴露于兩種不同焦油釋放量的卷煙產(chǎn)生的煙氣中以模擬人體暴露煙氣環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品1、樣品2卷煙煙氣均可誘導(dǎo)Beas-2b細(xì)胞毒性，IL-6、IL-8的分泌和細(xì)胞凋亡；這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)[9-13]研究結(jié)果卷煙煙氣可引起人支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率降低，肺細(xì)胞凋亡及促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8釋放增加一致。

焦油是卷煙煙氣中許多物質(zhì)混合而成的粒相物，其包括醛類[14]、砷[15]、NNK[16]和苯并[a]芘[17-18]等，研究表明，這些成分均可引起細(xì)胞存活率降低、引起支氣管炎癥和細(xì)胞凋亡等。且研究發(fā)現(xiàn)在降低卷煙焦油釋放量的同時(shí)也降低了卷煙煙氣中其他粒相成分[19]、氣相成分如CO[20-21]和揮發(fā)性羰基物(甲醛、巴豆醛、乙醛)等有害成分的釋放量[22]。因此，這可能是引起在相同0.57%、1%支煙氣劑量下，樣品1卷煙煙氣致Beas-2b存活率小于樣品2卷煙煙氣的原因。另外，在0.12%支煙氣劑量下，樣品1卷煙煙氣致Beas-2b存活率、引起的炎癥因子釋放水平和細(xì)胞凋亡水平與樣品2卷煙煙氣差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果可能是由于在相同該煙氣劑量下，兩種焦油釋放量卷煙的焦油劑量差較低(0.12%支煙氣劑量下，樣品1煙氣組和樣品2煙氣組換算焦油劑量分別為11.3和16.8μg，0.57%支煙氣劑量下，樣品1煙氣組和樣品2煙氣組換算焦油劑量分別為53.6和79.8μg)引起的。事實(shí)上，煙氣成分復(fù)雜，與卷煙配方、輔助材料和加工工藝等有關(guān)，另外卷煙煙氣暴露引起細(xì)胞毒性、促炎和細(xì)胞凋亡機(jī)制還需進(jìn)一步研究，在改變焦油釋放量的同時(shí)煙氣化學(xué)組成也發(fā)生了相應(yīng)的變化，因此有關(guān)煙草制品煙氣化學(xué)成分分析、煙氣體外毒性機(jī)制測試及臨床研究仍需進(jìn)一步研究，以期為煙草制品的健康風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

總之，本研究結(jié)果表明，兩種不同焦油釋放量卷煙樣品均可引起細(xì)胞毒性、促炎癥因子釋放和細(xì)胞凋亡作用。在0.12%支的煙氣劑量范圍內(nèi)，兩種卷煙致細(xì)胞毒性、炎癥因子釋放水平和細(xì)胞凋亡率并無顯著性差異，在0.57%支～1%支煙氣劑量范圍內(nèi)，具有高焦油釋放量的卷煙煙氣引起的細(xì)胞毒性強(qiáng)于低焦油釋放量的卷煙煙氣。