熱毒寧注射液治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分與潛在作用機(jī)制初探

陳元堃，曾奧，羅振輝，何樹苗，李春梅，盧群

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具傳染性強(qiáng)、傳播迅速、各類人群均易感等特點(diǎn)，其傳播的途徑主要包括了飛沫、接觸、糞口等[1]。輕度感染患者表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳及乏力等癥狀，而重度患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的急性呼吸衰竭、膿毒癥、腎衰甚至死亡等[2-3]。到目前為止仍無治療COVID-19的特效方法，主要采用中西醫(yī)臨床對癥治療的方式來應(yīng)對[4-5]。

在疫情防治中中醫(yī)的整體觀及辨證論治特點(diǎn)優(yōu)勢十分顯著，在國家健康委辦公廳印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》中，就包含了熱毒寧注射液[6]。熱毒寧注射液主要由梔子、金銀花、青蒿等三味中藥組成，多應(yīng)用在外感風(fēng)熱所引起的上呼吸道感染、咳嗽、微惡風(fēng)寒、感冒等[7]，對多種病毒具有抑制作用，如肺內(nèi)鼠巨細(xì)胞病毒、CVA16、甲型HIN1等[8]；相關(guān)機(jī)構(gòu)藥效篩選后初步發(fā)現(xiàn)熱毒寧、金振口服液等中成藥在體外具有抑制SARS-CoV-2的作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出熱毒寧注射液中的核心成分，并通過分析軟件進(jìn)一步探討其與受體的分子對接結(jié)果和信號通路等，從而對治療COVID-19的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療COVID-19提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 熱毒寧中主要中藥成分的獲取及篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及在線分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)收集青蒿、金銀花、梔子的主要活性成分?？诜锢枚?OB)為藥物的吸收、分布、代謝及排泄中的重要藥代學(xué)參數(shù)之一，主要指口服藥物中的有效成分和活性基等進(jìn)入人體循環(huán)并被吸收的速度及程度，而OB值越高則代表此藥物的生物活性、類藥性(DL)越佳[9-10]。故本文以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為篩選條件來篩選出候選的活性成分。

1.2 預(yù)測COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)

將“novel coronavirus pneumonia”作為檢索關(guān)鍵詞，選擇“Homo sapiens”物種，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得與COVID-19相關(guān)的基因。

1.3 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測及篩選重合靶點(diǎn)

通過TCMSP平臺(tái)檢索獲得青蒿、金銀花、梔子的靶蛋白，并利用Perl腳本篩選出候選活性成分的靶蛋白，剔除沒有對應(yīng)活性成分的靶蛋白，并將靶蛋白標(biāo)準(zhǔn)化建立數(shù)據(jù)集。通過R語言將上文獲得的COVID-19相關(guān)的靶點(diǎn)與藥物候選靶點(diǎn)取交集用于以下的分析。將獲得的交集部分以及中藥、候選活性成分整合為“network”、“node”文件，將其導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2中構(gòu)建藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

對獲得的疾病與藥物的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING進(jìn)行分析，物種選擇“Homo sapiens”，將置信度>0.7作為篩選指標(biāo)。將獲得的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2進(jìn)行蛋白-蛋白(PPI)互作模型的建立，并使用其中的分析工具(Network analyzer)及插件(MCODE)分析PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 KEGG和GO富集分析

利用DAVID平臺(tái)進(jìn)行GO及KEGG的富集分析，分析靶點(diǎn)涉及的基因功能及相應(yīng)的信號通路，以P<0.05為篩選指標(biāo)，并利用R語言將其可視化。

1.6 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫中下載目標(biāo)蛋白的PDB文件，并用Discovery Studio 4.5 Client對目標(biāo)蛋白進(jìn)行刪除水、加氫、確定對接位點(diǎn)等操作。利用ChemBio Draw Ultra 14.0、ChemBio3D Ultra 14.0畫出關(guān)鍵化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并將其轉(zhuǎn)化為pbdqt格式。利用vina完成受體與配體的對接[11]，結(jié)合能若小于0表明受體與配體能夠自發(fā)的結(jié)合，當(dāng)前篩選活性靶點(diǎn)還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，故依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道本文將結(jié)合能≤5作為篩選熱毒寧注射液治療COVID-19的活性成分[12-13]。

2 結(jié)果

2.1 收集、篩選熱毒寧注射液活性成分及COVID-19潛在靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索收集到青蒿126個(gè)成分，梔子98個(gè)成分，金銀花236個(gè)成分。對得到的各中藥中化學(xué)成分依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18進(jìn)行篩選，并剔除沒有靶蛋白的化學(xué)成分，共得到50個(gè)有效的化學(xué)成分。在這些活性成分中，有的同時(shí)存在于3種中藥中，如β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、槲皮素(quercetin)等(見圖1)。同時(shí)，通過Genecards收集到COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)共251個(gè)。

圖1熱毒寧注射液中藥物-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖

Figure1Drug-active ingredient network of Reduning injection

2.2 熱毒寧注射液治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集得到金銀花、青蒿、梔子中50個(gè)化學(xué)成分的對應(yīng)靶點(diǎn)共231個(gè)。在藥物對靶點(diǎn)中，存在多個(gè)藥物共同擁有多個(gè)靶點(diǎn)的情況；以及在藥物活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)中，存在一個(gè)活性成分對應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)及多個(gè)活性成分對應(yīng)一個(gè)靶點(diǎn)的情況。利用Perl腳本取熱毒寧注射液中活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)與COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)的交集之后，共得到43個(gè)熱毒寧治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建及分析藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape_v3.7.2構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中有70個(gè)節(jié)點(diǎn)及161條邊，節(jié)點(diǎn)為活性成分及治療靶點(diǎn)基因，邊為它們之間相互作用的關(guān)系。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)活性成分對多個(gè)靶點(diǎn)起作用，且還存在多個(gè)活性成分對一個(gè)靶點(diǎn)有作用，這就體現(xiàn)了熱毒寧注射液多成分、多靶點(diǎn)相互協(xié)同治療COVID-19的特點(diǎn)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過STRING構(gòu)建的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見圖3。此網(wǎng)絡(luò)圖中有43個(gè)節(jié)點(diǎn)與459條邊，圖中節(jié)點(diǎn)越大表明其度值越大，邊越粗表明其評分越高及關(guān)系越密切，顏色的深淺與度值及介值呈正相關(guān)的關(guān)系。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)鋵傩苑治龊蟮贸?，IL-6、CASP3等度值大于平均節(jié)點(diǎn)度值，確定為這一網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，之后利用MCODE分析得到2個(gè)具有顯著性的子模塊。模塊1評分為20.000，包括22個(gè)節(jié)點(diǎn)與210條邊，以上提到的核心靶點(diǎn)都包含在內(nèi)；模塊2評分為4.333，包括7個(gè)節(jié)點(diǎn)與13條邊。見圖3。

注：綠色-金銀花; 紫色-青蒿;黃色-梔子; 多藥物-紅色; 藍(lán)色-基因。

圖2熱毒寧注射液藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

Figure2Drug-active ingredient-target network of Reduning injection

2.5 GO富集分析

GO富集分析后共得到125個(gè)富集的結(jié)果。其中生物過程(BP)有95個(gè)，主要涉及有RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控(positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter)、免疫反應(yīng)(immune response)、炎癥反應(yīng)(inflammtory response)等方面。細(xì)胞成分(CC)有12個(gè)，主要涉及有細(xì)胞核(nucleus)、胞液(cytosol)等。分子功能(MF)有15個(gè)，主要涉及到蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等。本文選出BP、CC、MF的前10項(xiàng)富集結(jié)果做圖4。

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析后，得到104條富集結(jié)果，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway)、毒感染相關(guān)通路(Influenza A、HTLV-I infection、Herpes simplex infection)、腫瘤相關(guān)通路(Pancreatic cancer、Small cell lung cancer)等，說明熱毒寧注射液可能通過以上通路對COVID-19有作用。本文選出KEGG的前10項(xiàng)富集結(jié)果作圖5。

2.7 分子對接

目前，多數(shù)研究認(rèn)為配體與受體在結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定的情況下能量越低就表明此受體與配體發(fā)生作用的可能越大。通過對接后發(fā)現(xiàn)，芹菜素、木犀草素與SARS-CoV-23CL水解酶結(jié)合的能量最低，分別為-32.21 7kJ/mol、-30.962 kJ/mol。此次研究中的主要成分與SARS-CoV-23CL水解酶的結(jié)合能都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于-5 kJ/mol，與目前報(bào)道中具有抗COVID-19作用的化學(xué)藥物瑞德西韋、利托那韋等相似，具體見表1。以上結(jié)果表明熱毒寧注射液中的主要成分與SARS-CoV-23CL水解酶的結(jié)合形成的構(gòu)象能量極低、結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、活性高，具體對接情況見圖6。

模塊1模塊2

圖3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
Figure3Protein interaction network

圖4GO富集結(jié)果
Figure4GO enrichment results

圖5KEGG富集結(jié)果
Figure5KEGG enrichment results

3 討論

本研究篩選出熱毒寧注射液中符合標(biāo)準(zhǔn)的成分有50個(gè)，對應(yīng)的靶點(diǎn)有231個(gè)，與COVID-19重合的有43個(gè)，表明了熱毒寧注射液通過多成分、多靶點(diǎn)的方式來防治COVID-19。

從藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，涉及靶點(diǎn)最多的化合物均屬于黃酮類化合物，主要為芹菜素(Apigenin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)，且這3種化合物度值均較大，表明其可能為發(fā)揮防治作用的主要化合物。多項(xiàng)研究指出，

表1 熱毒寧注射液關(guān)鍵成分與抗COVID-19化學(xué)藥物與SARS-CoV-23CL水解酶的結(jié)合能
Table1Binding energy of key components in Reduning injection and anti-COVID-19 chemical drug with SARS-CoV-23CL hydrolase

NO化合物化學(xué)式相對分子質(zhì)量CASSARS-CoV-2結(jié)合能/(kJ·mol-1)1芹菜素C15H10O5270.24520-36-53CL水解酶-32.2172木犀草素C15H10O6286.24491-70-33CL水解酶-30.9623槲皮素C15H14O9338.276151-25-33CL水解酶-30.5434山奈酚C15H10O6286.24520-18-33CL水解酶-30.5435異鼠李素C16H12O7316.26480-19-33CL水解酶-30.5436馬錢苷酸C16H24O10376.3622255-40-93CL水解酶-29.7067豆甾醇C29H48O412.6983-48-73CL水解酶-28.900 8β-谷甾醇C29H50O414.7183-46-53CL水解酶-27.2169瑞德西韋C27H35N6O8P602.581809249-37-33CL水解酶-32.63510利托那韋C37H48N6O5S2720.96155213-67-53CL水解酶-31.79811洛匹那韋C37H48N4O5628.8192725-17-03CL水解酶-30.96212硝唑尼特C12H9N3O5S307.2855981-09-43CL水解酶-27.19613利巴韋林C8H12N4O5244.236791-04-53CL水解酶-25.10414氯喹C18H26ClN3319.87198513CL水解酶-24.267

圖6SARS-CoV-23CL以及ACE2與芹菜素和木犀草素分子對接情況
Figure6SARS-CoV-23CL hydrolase and ACE2 docking with Apigenin and Luteolin

黃酮類化合物對柯薩奇病毒、流感病毒及乙肝病毒在內(nèi)的多種病毒具有較強(qiáng)的抵抗作用[14]。芹菜素是一種潛力極大的天然化合物，其具有抗炎、抗癌、抗菌及抗病毒等多種功效[15]，對口蹄疫病毒有較強(qiáng)的抑制作用，且可阻礙病毒的翻譯活動(dòng)[16]。木犀草素因結(jié)構(gòu)中含5-OH等，故表現(xiàn)出優(yōu)越的抗病毒效果，如其對HIV-1中的蛋白酶及整合酶有較強(qiáng)的抑制作用，還具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[17]。此外，槲皮素是一種明星化合物，近幾年來對其研究較多[18]。槲皮素可通過阻礙病毒受體復(fù)合物進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)，阻斷病毒的生活周期，最后導(dǎo)致其死亡[19]。LEE等[20]指出，槲皮素可通過抑制TLR-3的表達(dá)來影響炎癥轉(zhuǎn)錄因子，從而起到抗HSV-1的效果。綜上所述，熱毒寧注射液中主要化合物均具較強(qiáng)的抑制病毒作用，進(jìn)一步證明了熱毒注射液的抗病毒功效。

在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，度值大于節(jié)點(diǎn)平均度值的靶點(diǎn)有IL-6、CASP3、MAPK8、MAPK1等。IL-6為機(jī)體內(nèi)參與信息傳遞及調(diào)節(jié)激活免疫細(xì)胞的一種細(xì)胞因子，IL-6的表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[21]。程林等[22]發(fā)現(xiàn)，在HIV患者體內(nèi)sPD-1的過表達(dá)可能與HIV-1誘導(dǎo)IL-6分泌有關(guān)，從而使患者免疫系統(tǒng)清除HIV-1這一活動(dòng)受到阻礙。昌仲勇等[23]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合血清IL-6、hs-CRP、PCT檢查對COVID-19患者的預(yù)后及死亡風(fēng)險(xiǎn)具有很好的判斷作用。CASP3為多條凋亡途徑下游的共同效應(yīng)成分，在多種細(xì)胞的凋亡中處于核心地位，被認(rèn)為是執(zhí)行死亡的蛋白酶。藥物可通過影響CASP3從而起到抗病毒、抗腫瘤等作用[24]。劉曉婷等[25]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過影響CASP3與CASP8的表達(dá)來改善流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。MAPK8、MAPK1均屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族里的成員，其可在多種環(huán)境應(yīng)激中被激活，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、病毒感染、癌癥等[26]。MIZUTANI等[27]發(fā)現(xiàn)在SARS-CoV感染的細(xì)胞中P38MAPK、MAPKAPK-2、HSP-27、CREB、eIF4E的下游靶點(diǎn)均可被磷酸化，同時(shí)在其他冠狀病毒的感染中MAPK家族成員也可被激活。

GO與KEGG的富集結(jié)果主要涉及細(xì)菌感染、病毒感染、腫瘤等方面，說明熱毒寧注射液中的多種活性組分可能通過對COVID-19中失衡的通路進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，從而起到防治的作用。陳躍宣等[28]利用熱毒寧聯(lián)合阿奇霉素治療支原體肺炎的患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合治療時(shí)療效好且可使患者血清中的促炎因子、抗炎因子及細(xì)胞的免疫指標(biāo)得到改善。趙志勇等[29]得出用熱毒寧與大劑量的丙種球蛋白來聯(lián)合治療患兒的急性重癥病毒性肺炎的療效好、安全性高、預(yù)后佳，且較以往的病程大大縮短。本研究得出結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了熱毒寧注射液在肺部疾病中的療效。

從分子對接的結(jié)果可知，芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚等與目前臨床上推薦的對COVID-19有效的化學(xué)藥物的結(jié)合能相近。有研究提出，SARS-CoV-2及SARS-CoV表達(dá)的S蛋白與機(jī)體中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE2)結(jié)合后可使病毒入侵，從而進(jìn)一步導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本研究將熱毒寧注射液中的主要成分(芹菜素、木犀草素)與ACE2來進(jìn)行分子對接。對接后發(fā)現(xiàn)芹菜素、木犀草素與ACE2的結(jié)合能均小于-5，分別為24.267 kJ/mol、23.849 kJ/mol。

綜上所述，研究中結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法對熱毒寧注射液抗COVID-19的化學(xué)成分、靶點(diǎn)、作用機(jī)制以及主要成分與SARS-CoV-2水解酶和ACE2的結(jié)合能作出了初步的預(yù)測，為日后的抗新型肺炎藥物的研發(fā)提供了一個(gè)思路。但本研究還存在有一定的局限性，如數(shù)據(jù)庫不完整、忽略了中藥中成分的含量、在機(jī)體內(nèi)其他藥代動(dòng)力學(xué)的作用等。對于以上存在的這些問題，后期可通過進(jìn)行藥效和臨床治療效果的探究，更深入地驗(yàn)證，為新藥物的研發(fā)提供新思路及方向。