• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葉酸代謝通路常見基因多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法

    2020-06-03 06:39:36何震宇
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    何震宇

    (廣東藥科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,廣東 廣州 510006)

    葉酸是一種人體必需的B族維生素,它在人體中經(jīng)過兩步還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸(FH4)。FH4能夠攜帶一碳單位參與(脫氧)核苷酸的合成,從而間接參與核酸的合成。FH4可以轉(zhuǎn)變?yōu)镹5,N10-亞甲四氫葉酸,N5,N10-亞甲四氫葉酸能被5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镹5-甲基四氫葉酸(N5-CH3-FH4)。N5-CH3-FH4在甲硫氨酸合成酶的催化下提供甲基使同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸,同時(shí)釋放出游離的FH4,這步反應(yīng)具有如下意義:(1)降低血液中同型半胱氨酸水平,而同型半胱氨酸為動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;(2)促進(jìn)FH4的再生;(3)甲硫氨酸可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM),SAM為體內(nèi)重要的甲基供體,很多重要的生理活性物質(zhì)比如腎上腺素、肉堿、膽堿及肌酸等的合成需要它提供甲基,DNA、蛋白質(zhì)等的甲基化也有賴于它[1]。甲硫氨酸合成酶發(fā)揮活性需要輔助因子維生素B12,但維生素B12容易氧化失活從而導(dǎo)致甲硫氨酸合成酶失活。甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MSR)又叫5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶還原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase,MTRR),它能使氧化型維生素B12發(fā)生甲基化還原生成有活性的維生素B12從而恢復(fù)甲硫氨酸合成酶的活性[2]。綜上所述,不難看出,葉酸代謝通路對(duì)維持人體健康至關(guān)重要,該代謝通路的關(guān)鍵酶MTHFR、MTRR如果存在遺傳缺陷的話,勢(shì)必會(huì)不同程度地影響人體健康。目前,對(duì)人體健康影響最大、受關(guān)注度最高的基因多態(tài)位點(diǎn)為MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G位點(diǎn)。

    1 葉酸代謝常見基因多態(tài)位點(diǎn)及臨床意義

    1.1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)和A1298C位點(diǎn)

    5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因MTHFR基因定位于1p36.3[3],包含11個(gè)外顯子[4]。MTHFR基因錯(cuò)義突變是引起酶活性缺乏和降低的主要機(jī)制,最常見的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是C677T,它會(huì)導(dǎo)致多肽鏈相應(yīng)的丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)取代,從而降低MTHFR的熱穩(wěn)定性和活性,在46 ℃加熱5 min的情況下,CC、CT、TT基因型樣品殘余的酶活性分別為67%、56%、22%;正常情況下,TT型樣品的活性約為CC型樣品的50%[5-6]。另一個(gè)常見的多態(tài)位點(diǎn)是A1298C,它由Viel A等[7]最先發(fā)現(xiàn),該突變可導(dǎo)致多肽鏈中相應(yīng)的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代,使用淋巴細(xì)胞提取液測(cè)定酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn),CC型突變純合子的酶活性大約只有正常野生型純合子酶活性的60%,A1298C和C677T雙雜合子的酶活性為野生型的50%~60%[8];使用體外表達(dá)的酶進(jìn)行研究表明,相較于野生型酶,1298C單位點(diǎn)突變、677T單位點(diǎn)突變、1298C和677T雙位點(diǎn)突變酶的活性分別為68%、45%、41%[9]。

    1.2 MTRR基因A66G位點(diǎn)

    甲硫氨酸合成酶還原酶的編碼基因MTRR基因定位于5p15.2-15.3[10],大約34 kb,包含15個(gè)外顯子[11]。

    MTRR基因最常見的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是A66G,它會(huì)導(dǎo)致多肽鏈第22位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代(I22M),體外研究表明,要想使甲硫氨酸合成酶達(dá)到最大反應(yīng)速度,M22變異體相對(duì)于I22野生型酶而言,反應(yīng)體系中使用甲硫氨酸合成酶還原酶與甲硫氨酸合成酶的比率要高3~4倍[2],意味著該位點(diǎn)對(duì)甲硫氨酸合成酶還原酶的活性影響非常之大。

    顯然,上述3個(gè)位點(diǎn)都會(huì)對(duì)其相應(yīng)的酶活性造成較大影響,從而引起血漿同型半胱氨酸水平上升、一碳單位代謝障礙,與唐氏綜合征[12-13]、唇腭裂[14-15]、神經(jīng)管缺陷[16-17]、心腦血管疾病[18-22]、自閉癥[23]、精神分裂癥[24]、腫瘤[25-26]、反復(fù)自然性流產(chǎn)[27]、男性不育[28]等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

    中國(guó)人群C677T、A1298C和A66G多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率存在顯著的地理和種族差異[29],見表1。因此,加強(qiáng)這3個(gè)位點(diǎn)的基因分型研究,對(duì)臨床疾病診斷及風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)具有重要意義。

    2 針對(duì)葉酸代謝通路常見多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法

    2.1 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)

    該法先用PCR擴(kuò)增包含多態(tài)位點(diǎn)的DNA片段,然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,酶切產(chǎn)物再通過電泳予以分離,根據(jù)電泳圖譜中酶切片段的數(shù)目和大小判斷基因型。 其中MTHFR基因C677T位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列GAGYC(Y=C或T),突變型等位基因T的相應(yīng)序列GAGTC能夠被限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ識(shí)別,反之,野生型等位基因C的相應(yīng)序列GAGCC不能被HinfⅠ識(shí)別,從而可用HinfⅠ甄別該位點(diǎn);MTHFR基因A1298C位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列GAAGM(M=A或C),野生型等位基因A的相應(yīng)序列GAAGA能夠被限制性核酸內(nèi)切酶MboⅡ識(shí)別,反之,突變型等位基因C的相應(yīng)序列GAAGC不能被MboⅡ識(shí)別,從而可用MboⅡ鑒定該位點(diǎn);MTRR基因A66G位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列AATRTG(R=A或G),本來沒有合適的限制性核酸內(nèi)切酶甄別該序列,但通過錯(cuò)配引物PCR將其變?yōu)镃ATRTG后,野生等位基因A的相應(yīng)序列為CATATG,能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識(shí)別,反之,突變型等位基因G的相應(yīng)序列為CATGTG,不能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識(shí)別,從而可以用NdeⅠ來鑒定該位點(diǎn),這個(gè)位點(diǎn)采用了所謂的引物介導(dǎo)的限制性分析 PCR (PCR-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)。Nasri等[30]在研究MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)與神經(jīng)管缺陷的關(guān)系時(shí),基因分型采用的正是PCR-RFLP法。盡管PCR-RFLP法是一種經(jīng)典的基因分型方法,操作簡(jiǎn)單,對(duì)儀器設(shè)備要求低,但由于涉及酶切反應(yīng),酶切不完全容易導(dǎo)致基因型誤判,不過在PCR產(chǎn)物中引入內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)可以克服這一缺點(diǎn)[31]。此外,目前針對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)需要使用3種不同的內(nèi)切酶,難以在同一反應(yīng)體系進(jìn)行3個(gè)位點(diǎn)的酶切反應(yīng),若能實(shí)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)的同管酶切檢測(cè),必將大幅提高檢測(cè)效率。

    表1 中國(guó)不同地區(qū)葉酸代謝基因主要多態(tài)位點(diǎn)突變等位基因及基因型頻率
    Table1Mutant alleles and genotypes frequencies of major polymorphisms of folate metabolism genes in different regions of China

    多態(tài)位點(diǎn)(突變等位基因在后)地區(qū)突變純合子基因型頻率/%突變等位基因頻率/%MTHFR基因 C677T南方7(5-8)25(23-27)中部19(16-21)41(36-45)北方28(25-31)53(51-55)MTHFR基因 A1298C南方7(5-9)28(24-31)中部4(3-4)18(17-19)北方3(2-3)17(16-19)MTRR基因A66G南方8(6-10)29(28-31)中部6(6-7)25(23-27)北方6(5-6)24(23-25)

    2.2 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(amplication refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)

    該法又叫等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR),它使用針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的2種等位基因特異性引物即野生型引物PW和突變型引物PM配合常規(guī)引物進(jìn)行PCR,通過電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否出現(xiàn)PW、PM特異的目的條帶來分辨基因型[32-33]。Lajin B等[34]使用該技術(shù)成功地建立了一種同管檢測(cè)MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)3個(gè)位點(diǎn)的方法,并檢測(cè)了126例樣本。該方法只需PCR反應(yīng)和常規(guī)的電泳就可檢測(cè)樣本基因型,簡(jiǎn)便、快速、成本低,但影響特異性擴(kuò)增的因素較多,PCR條件優(yōu)化不當(dāng)時(shí)容易造成基因分型錯(cuò)誤。

    2.3 測(cè)序(Sequencing)

    Sanger測(cè)序(雙脫氧鏈終止法)是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但需要昂貴的測(cè)序儀器和專業(yè)操作人員。Guo QN等[35]在一項(xiàng)研究中檢測(cè)了212名個(gè)體MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型,它們均由專業(yè)測(cè)序公司采用Sanger測(cè)序法完成。

    焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)是可與Sanger測(cè)序媲美的另一種測(cè)序技術(shù)。其原理是:引物與模板DNA退火后,在4種酶的協(xié)同作用下,將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來,通過檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。該方法不僅需要昂貴的焦磷酸測(cè)序儀,而且測(cè)序反應(yīng)體系中每種成分和參數(shù)的優(yōu)化都比較麻煩。Roberto M等[36]在研究參與氟嘧啶代謝和5-氟尿嘧啶(5-FU)降解的基因的多態(tài)性時(shí),使用該法檢測(cè)了142例胃腸道腫瘤患者的MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)的基因型。

    2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR (real-time PCR,RT-PCR)

    該法是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的一種方法。在進(jìn)行SNP分型時(shí),PCR反應(yīng)體系里除了引物外,還有探針,最常見的為Taqman探針,每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因各有其標(biāo)記不同顏色熒光基團(tuán)的特異性探針,未發(fā)生PCR擴(kuò)增時(shí),探針上一側(cè)的熒光會(huì)被探針上另一側(cè)的淬滅基團(tuán)吸收,反應(yīng)體系無法檢測(cè)到熒光,一旦發(fā)生PCR擴(kuò)增,探針上的淬滅基團(tuán)會(huì)被水解,熒光基團(tuán)發(fā)出熒光隨即被檢測(cè),最后根據(jù)檢測(cè)到的累積熒光就可判斷樣品的基因型。墨西哥學(xué)者在研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度與相關(guān)單核苷酸多態(tài)性之間的潛在聯(lián)系時(shí),就采用基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)了MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型[37]。王蘇梅等[ 38]使用該法檢測(cè)了100例樣本,與PCR-RFLP法比較,符合率96%。該法操作簡(jiǎn)單、快速,但探針成本較高,且反應(yīng)體系中引物、探針的濃度乃至DNA聚合酶的用量均需優(yōu)化,給實(shí)驗(yàn)增加了一定的難度。

    2.5 高分辨熔解曲線技術(shù)( high-resolution melting,HRM)

    該法在PCR反應(yīng)體系中加入一種飽和熒光染料,該熒光染料能結(jié)合到雙鏈的DNA分子上,在PCR反應(yīng)結(jié)束后,不斷升溫,使PCR產(chǎn)物上的熒光染料不斷脫落導(dǎo)致熒光信號(hào)下降,從而繪制出相應(yīng)的熔解曲線,并根據(jù)熔解曲線的變化判斷樣本的基因型,因?yàn)椴煌蛐蜆颖綪CR產(chǎn)物的堿基序列存在差異,解鏈行為不同導(dǎo)致熔解曲線存在差異。潘登等[39]使用該法檢測(cè)了96例樣本MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型,分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。李玲使用該法檢測(cè)了1 000份樣品,其中只有2例與測(cè)序結(jié)果不符,準(zhǔn)確率99.8%[40]。HRM法操作簡(jiǎn)便、快速,不需要探針,但對(duì)儀器溫度的均一性要求非常高,反應(yīng)條件極為苛刻,必須反復(fù)摸索。

    2.6 變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)

    該方法是先通過PCR獲得靶DNA分子,然后將DNA分子進(jìn)行變性和復(fù)性,雜合子樣品在復(fù)性的過程中會(huì)形成同源雙鏈和異源雙鏈,在部分變性溫度條件下,異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性,在色譜柱中的保留時(shí)間少于同源雙鏈,故先被洗脫下來,出現(xiàn)2個(gè)峰或多個(gè)峰。李才明等[41]用此法檢測(cè)了334例南方漢族人的MTHFR基因C677T位點(diǎn),CT基因型顯示為2個(gè)峰,而CC和TT基因型標(biāo)本在單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)僅出現(xiàn)單峰,而將CC和TT基因型的PCR產(chǎn)物混合后再進(jìn)樣,可出現(xiàn)與CT基因型標(biāo)本類似的雙峰,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證,準(zhǔn)確率99%以上。DHPLC檢測(cè)高效快速,但對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高,否則容易產(chǎn)生誤差。

    2.7 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)

    它是將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后使用引物延伸單個(gè)堿基(多態(tài)位點(diǎn)堿基),根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP。該法分析速度快、準(zhǔn)確度高,但需要昂貴的質(zhì)譜儀,且對(duì)操作人員要求高。Suthandiram S等[42]使用Sequenom-MassARRAY平臺(tái)對(duì)372名非霍奇金淋巴瘤患者和722名對(duì)照者進(jìn)行基因分型以研究MTHFR基因 C677T和A1298C單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。

    2.8 DNA微陣列(DNA Microarray)

    該技術(shù)在芯片上固定不同基因位點(diǎn)的特異性探針,然后與熒光標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交,通過雜交信號(hào)來判斷基因型。Gra O等[43]采用一種名叫“Pharmagen biochip”的DNA微陣列檢測(cè)了352名健康志愿者的MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型。這類方法可一次性檢測(cè)出多個(gè)SNP位點(diǎn),但特異性較差,樣品的制備和標(biāo)記較為繁瑣,檢測(cè)成本高。

    2.9 探針介導(dǎo)的重組酶擴(kuò)增(probe-directed recombinase amplification,PDRA)

    該方法雖然也涉及核酸的擴(kuò)增,但屬于恒溫?cái)U(kuò)增,不需像PCR那樣設(shè)置溫度循環(huán)。它針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)設(shè)立2個(gè)實(shí)時(shí)反應(yīng)體系,每個(gè)反應(yīng)體系包含一條序列一致的引物和一條等位基因特異的探針,此外,還含有單鏈結(jié)合蛋白SSB、重組酶UvsX、DNA 聚合酶、核酸外切酶Ⅲ等主要成分。當(dāng)探針與靶DNA特異性雜交結(jié)合后,能夠被核酸外切酶Ⅲ在 多態(tài)位點(diǎn)3′端附近的一個(gè)人為引進(jìn)的四氫呋喃位點(diǎn)發(fā)生切割,切割產(chǎn)生的5′端片段能充當(dāng)引物,在SSB、UvsX、DNA 聚合酶的協(xié)同作用下完成靶序列的擴(kuò)增,切下的3′端片段上的熒光基團(tuán)則能發(fā)出熒光,通過相關(guān)儀器收集累積的熒光信號(hào)就能判斷基因型。Duan S等[44]使用該法檢測(cè)了150例先天性心臟病患者的MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的基因型,擴(kuò)增反應(yīng)在39 ℃下35 min內(nèi)便可完成,分型結(jié)果與直接測(cè)序完全吻合。本法操作簡(jiǎn)便、快速,但引物的設(shè)計(jì)非常受限,引物的修飾標(biāo)記比較麻煩,只能用于部分多態(tài)位點(diǎn)的基因分型。

    2.10 PCR-金磁微粒層析法(PCR-gold magnetic nanoparticles-based lateral flow assay)

    該法先利用AMRS-PCR對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物兩端分別帶有地高辛及生物素標(biāo)記,它們經(jīng)過金磁微粒層析系統(tǒng)時(shí),與層析體系中的偶聯(lián)地高辛單抗的金磁微粒及鏈親和素結(jié)合形成復(fù)合物,在層析試紙條的檢測(cè)線處聚集大量磁粒,進(jìn)而呈現(xiàn)紅色條帶,無擴(kuò)增結(jié)果則在檢測(cè)線上無條帶呈現(xiàn)。Hui W等[45]使用該法檢測(cè)了1 721例標(biāo)本,分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合率高達(dá)99.6%。本法操作簡(jiǎn)單,無需大型貴重儀器,PCR結(jié)束后10 min內(nèi)可得到目視化結(jié)果,但引物標(biāo)記、金磁微粒層析系統(tǒng)成本不菲,而且也難以避免AMRS-PCR本身的弊端。

    綜上所述,目前對(duì)葉酸代謝通路3個(gè)主要單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法較多,各有其優(yōu)缺點(diǎn),在各種科學(xué)研究及臨床檢測(cè)中,應(yīng)綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本、實(shí)驗(yàn)周期、結(jié)果的準(zhǔn)確性及相應(yīng)的儀器、設(shè)備條件,選擇合適的分型方法。

    猜你喜歡
    檢測(cè)
    QC 檢測(cè)
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
    “有理數(shù)”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    天天一区二区日本电影三级| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久香蕉精品热| 少妇丰满av| 天天添夜夜摸| 一进一出抽搐动态| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久99热这里只有精品18| 亚洲av第一区精品v没综合| x7x7x7水蜜桃| 中文资源天堂在线| 亚洲专区国产一区二区| 99re在线观看精品视频| 欧美zozozo另类| 首页视频小说图片口味搜索| 国产伦一二天堂av在线观看| 色在线成人网| 久久中文字幕一级| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 岛国在线观看网站| 丁香欧美五月| 制服丝袜大香蕉在线| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美国产在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲精品久久久com| svipshipincom国产片| 老司机深夜福利视频在线观看| 男人舔奶头视频| 九色成人免费人妻av| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 麻豆成人av在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 99国产综合亚洲精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 怎么达到女性高潮| 色哟哟哟哟哟哟| 久久天堂一区二区三区四区| 久久性视频一级片| 99热这里只有是精品50| 国产极品精品免费视频能看的| 在线永久观看黄色视频| 俺也久久电影网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲片人在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| a级毛片在线看网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品国内亚洲2022精品成人| 18禁观看日本| 久久中文字幕一级| 欧美国产日韩亚洲一区| 一本综合久久免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产伦人伦偷精品视频| 国产淫片久久久久久久久 | 麻豆成人av在线观看| av欧美777| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 九九在线视频观看精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美色视频一区免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 好男人电影高清在线观看| 国产成人福利小说| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲在线观看片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 国产美女午夜福利| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人久久性| 久久久久久久久久黄片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 又大又爽又粗| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 日韩免费av在线播放| 亚洲中文av在线| 操出白浆在线播放| 男女那种视频在线观看| 嫩草影视91久久| 国产成年人精品一区二区| 欧美乱妇无乱码| xxx96com| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产精品电影一区二区三区| 免费看a级黄色片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线免费观看不下载黄p国产 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 黄色丝袜av网址大全| 国产黄片美女视频| 1024香蕉在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 91在线观看av| 色噜噜av男人的天堂激情| 中亚洲国语对白在线视频| 成人三级做爰电影| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品久久久人人做人人爽| www.www免费av| 国产 一区 欧美 日韩| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本精品一区二区三区蜜桃| 热99re8久久精品国产| 一级毛片高清免费大全| 亚洲自拍偷在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产av一区在线观看免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美激情在线99| svipshipincom国产片| h日本视频在线播放| 在线视频色国产色| 俺也久久电影网| 窝窝影院91人妻| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 桃色一区二区三区在线观看| 国产黄片美女视频| 99在线人妻在线中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 成年版毛片免费区| 亚洲精品粉嫩美女一区| www国产在线视频色| av福利片在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 99久久国产精品久久久| 又紧又爽又黄一区二区| av在线天堂中文字幕| 色av中文字幕| 国产高潮美女av| 国产精品精品国产色婷婷| 特大巨黑吊av在线直播| 两个人的视频大全免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 色哟哟哟哟哟哟| 久久中文字幕一级| 国产av一区在线观看免费| 一区二区三区高清视频在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99热这里只有是精品50| 久久人人精品亚洲av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 少妇的逼水好多| 男人舔女人下体高潮全视频| 麻豆成人午夜福利视频| 岛国在线观看网站| 综合色av麻豆| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线观看66精品国产| 亚洲精品美女久久av网站| 国产单亲对白刺激| 999精品在线视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产高清videossex| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品女同一区二区软件 | 久久精品综合一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品,欧美在线| 国产成人av教育| 国内精品一区二区在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲第一电影网av| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 久久人妻av系列| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一级毛片高清免费大全| 欧美黑人欧美精品刺激| 老司机福利观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲七黄色美女视频| 伦理电影免费视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品久久久久久久电影 | 很黄的视频免费| 在线a可以看的网站| 国产三级黄色录像| 久久午夜综合久久蜜桃| 91av网一区二区| 免费观看的影片在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 99热只有精品国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲av高清不卡| 99国产综合亚洲精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女午夜性视频免费| 午夜精品在线福利| 国产精品国产高清国产av| 久久精品国产清高在天天线| 在线看三级毛片| 久久香蕉精品热| 免费观看人在逋| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产又色又爽无遮挡免费看| 99久久国产精品久久久| 色哟哟哟哟哟哟| 国产成人精品久久二区二区91| 99精品在免费线老司机午夜| 美女黄网站色视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩欧美 国产精品| 欧美激情在线99| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲美女视频黄频| 性欧美人与动物交配| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕av在线有码专区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 九九在线视频观看精品| 欧美黑人巨大hd| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品久久久久久精品电影| aaaaa片日本免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 69av精品久久久久久| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| av中文乱码字幕在线| 欧美乱妇无乱码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99热只有精品国产| 欧美极品一区二区三区四区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美激情在线99| 99久久99久久久精品蜜桃| 黄片小视频在线播放| 国产单亲对白刺激| 国产野战对白在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 成人av一区二区三区在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品国产高清国产av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品电影一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 国产精品永久免费网站| 久久亚洲精品不卡| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜精品久久久久久毛片777| 国语自产精品视频在线第100页| 一个人免费在线观看的高清视频| 麻豆一二三区av精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本黄色片子视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲五月婷婷丁香| 熟女电影av网| 国产成人影院久久av| 亚洲最大成人中文| 一夜夜www| 久久久精品大字幕| 欧美午夜高清在线| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲人与动物交配视频| 国产乱人视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 小说图片视频综合网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 午夜福利18| 一级作爱视频免费观看| 一区二区三区高清视频在线| av女优亚洲男人天堂 | 国产成人aa在线观看| 午夜两性在线视频| 又大又爽又粗| 午夜两性在线视频| 日韩高清综合在线| av天堂中文字幕网| 天天躁日日操中文字幕| h日本视频在线播放| 两个人视频免费观看高清| 一本综合久久免费| 欧美日韩乱码在线| 超碰成人久久| 日韩欧美免费精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 中文字幕高清在线视频| 90打野战视频偷拍视频| netflix在线观看网站| 国产av不卡久久| 国产精品一区二区免费欧美| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99久久精品热视频| 伦理电影免费视频| 色吧在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 久久久成人免费电影| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一a级毛片在线观看| 91麻豆av在线| av国产免费在线观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久性生活片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品综合久久久久久久免费| av女优亚洲男人天堂 | 国产单亲对白刺激| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美在线黄色| 成人亚洲精品av一区二区| av国产免费在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 男女午夜视频在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 大型黄色视频在线免费观看| 91av网站免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜亚洲福利在线播放| 91在线观看av| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av五月六月丁香网| 天天躁日日操中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 俺也久久电影网| 亚洲熟女毛片儿| а√天堂www在线а√下载| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产三级黄色录像| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 麻豆一二三区av精品| 九九热线精品视视频播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 韩国av一区二区三区四区| 99国产综合亚洲精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情在线99| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 精品免费久久久久久久清纯| 国产毛片a区久久久久| 制服丝袜大香蕉在线| 超碰成人久久| 嫩草影院入口| 精品不卡国产一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲电影在线观看av| 黄片大片在线免费观看| 国产高清视频在线播放一区| 无人区码免费观看不卡| 无遮挡黄片免费观看| 99久久综合精品五月天人人| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美大码av| 五月玫瑰六月丁香| 一级毛片高清免费大全| 免费观看人在逋| 国产精品乱码一区二三区的特点| 中亚洲国语对白在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲五月婷婷丁香| 18禁观看日本| 国产精品亚洲av一区麻豆| www日本黄色视频网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久久久久久黄片| 国产1区2区3区精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人精品无人区| 日韩精品中文字幕看吧| 麻豆av在线久日| 成年女人看的毛片在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 免费看a级黄色片| 99久国产av精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品456在线播放app | 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 嫩草影院精品99| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 69av精品久久久久久| 小说图片视频综合网站| 成人av在线播放网站| 日本五十路高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99久久99久久久精品蜜桃| 性色av乱码一区二区三区2| www日本在线高清视频| 亚洲五月天丁香| 全区人妻精品视频| 亚洲人成电影免费在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日本 欧美在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久亚洲真实| 曰老女人黄片| 久久久色成人| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久九九精品影院| 欧美日韩黄片免| 精品欧美国产一区二区三| 97碰自拍视频| 国产v大片淫在线免费观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 脱女人内裤的视频| 制服丝袜大香蕉在线| 一二三四在线观看免费中文在| 免费观看的影片在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 在线国产一区二区在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美三级亚洲精品| 亚洲成人久久爱视频| 国产三级在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费观看人在逋| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人av教育| 美女午夜性视频免费| 观看免费一级毛片| 最近视频中文字幕2019在线8| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 最近在线观看免费完整版| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产成人欧美在线观看| 丰满的人妻完整版| 99国产精品99久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产极品精品免费视频能看的| 免费在线观看亚洲国产| 美女大奶头视频| 久久国产精品人妻蜜桃| av在线天堂中文字幕| 免费av不卡在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产av在哪里看| 色尼玛亚洲综合影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 中文资源天堂在线| 性色avwww在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲美女视频黄频| 看片在线看免费视频| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美日韩国产亚洲二区| a在线观看视频网站| av在线蜜桃| 日本黄色片子视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 一二三四在线观看免费中文在| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品女同一区二区软件 | 免费在线观看亚洲国产| 精品国产美女av久久久久小说| 中文字幕高清在线视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 此物有八面人人有两片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产黄a三级三级三级人| 超碰成人久久| 1024手机看黄色片| 精品久久久久久,| 天堂影院成人在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 美女被艹到高潮喷水动态| 69av精品久久久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 成人亚洲精品av一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 岛国在线观看网站| 操出白浆在线播放| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国内精品一区二区在线观看| av女优亚洲男人天堂 | 中文字幕久久专区| 亚洲国产欧美人成| av福利片在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 1024香蕉在线观看| 亚洲专区字幕在线| 青草久久国产| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 97碰自拍视频| 午夜久久久久精精品| 偷拍熟女少妇极品色| 日本黄色视频三级网站网址| 成年女人毛片免费观看观看9| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜激情欧美在线| 国产91精品成人一区二区三区| 国产午夜精品论理片| 午夜精品在线福利| 少妇丰满av| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品在线观看二区| xxx96com| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一级黄色大片毛片| 一级作爱视频免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久人妻av系列| 欧美日韩乱码在线| 在线观看66精品国产| 最近在线观看免费完整版| 色在线成人网| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天天躁日日操中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人av激情在线播放| cao死你这个sao货| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲电影在线观看av| 色av中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 国产视频一区二区在线看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av天堂中文字幕网| 又爽又黄无遮挡网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩精品中文字幕看吧| 精品一区二区三区四区五区乱码| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 色综合亚洲欧美另类图片| 无限看片的www在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品一及| 国产免费男女视频| 国产真实乱freesex| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩欧美在线乱码| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产高清激情床上av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲人成电影免费在线| 色吧在线观看|