何震宇
(廣東藥科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,廣東 廣州 510006)
葉酸是一種人體必需的B族維生素,它在人體中經(jīng)過兩步還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸(FH4)。FH4能夠攜帶一碳單位參與(脫氧)核苷酸的合成,從而間接參與核酸的合成。FH4可以轉(zhuǎn)變?yōu)镹5,N10-亞甲四氫葉酸,N5,N10-亞甲四氫葉酸能被5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镹5-甲基四氫葉酸(N5-CH3-FH4)。N5-CH3-FH4在甲硫氨酸合成酶的催化下提供甲基使同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸,同時釋放出游離的FH4,這步反應(yīng)具有如下意義:(1)降低血液中同型半胱氨酸水平,而同型半胱氨酸為動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生的獨立危險因素;(2)促進(jìn)FH4的再生;(3)甲硫氨酸可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM),SAM為體內(nèi)重要的甲基供體,很多重要的生理活性物質(zhì)比如腎上腺素、肉堿、膽堿及肌酸等的合成需要它提供甲基,DNA、蛋白質(zhì)等的甲基化也有賴于它[1]。甲硫氨酸合成酶發(fā)揮活性需要輔助因子維生素B12,但維生素B12容易氧化失活從而導(dǎo)致甲硫氨酸合成酶失活。甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MSR)又叫5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶還原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase,MTRR),它能使氧化型維生素B12發(fā)生甲基化還原生成有活性的維生素B12從而恢復(fù)甲硫氨酸合成酶的活性[2]。綜上所述,不難看出,葉酸代謝通路對維持人體健康至關(guān)重要,該代謝通路的關(guān)鍵酶MTHFR、MTRR如果存在遺傳缺陷的話,勢必會不同程度地影響人體健康。目前,對人體健康影響最大、受關(guān)注度最高的基因多態(tài)位點為MTHFR基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點。
5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因MTHFR基因定位于1p36.3[3],包含11個外顯子[4]。MTHFR基因錯義突變是引起酶活性缺乏和降低的主要機(jī)制,最常見的一個多態(tài)位點是C677T,它會導(dǎo)致多肽鏈相應(yīng)的丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)取代,從而降低MTHFR的熱穩(wěn)定性和活性,在46 ℃加熱5 min的情況下,CC、CT、TT基因型樣品殘余的酶活性分別為67%、56%、22%;正常情況下,TT型樣品的活性約為CC型樣品的50%[5-6]。另一個常見的多態(tài)位點是A1298C,它由Viel A等[7]最先發(fā)現(xiàn),該突變可導(dǎo)致多肽鏈中相應(yīng)的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代,使用淋巴細(xì)胞提取液測定酶活性時發(fā)現(xiàn),CC型突變純合子的酶活性大約只有正常野生型純合子酶活性的60%,A1298C和C677T雙雜合子的酶活性為野生型的50%~60%[8];使用體外表達(dá)的酶進(jìn)行研究表明,相較于野生型酶,1298C單位點突變、677T單位點突變、1298C和677T雙位點突變酶的活性分別為68%、45%、41%[9]。
甲硫氨酸合成酶還原酶的編碼基因MTRR基因定位于5p15.2-15.3[10],大約34 kb,包含15個外顯子[11]。
MTRR基因最常見的一個多態(tài)位點是A66G,它會導(dǎo)致多肽鏈第22位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代(I22M),體外研究表明,要想使甲硫氨酸合成酶達(dá)到最大反應(yīng)速度,M22變異體相對于I22野生型酶而言,反應(yīng)體系中使用甲硫氨酸合成酶還原酶與甲硫氨酸合成酶的比率要高3~4倍[2],意味著該位點對甲硫氨酸合成酶還原酶的活性影響非常之大。
顯然,上述3個位點都會對其相應(yīng)的酶活性造成較大影響,從而引起血漿同型半胱氨酸水平上升、一碳單位代謝障礙,與唐氏綜合征[12-13]、唇腭裂[14-15]、神經(jīng)管缺陷[16-17]、心腦血管疾病[18-22]、自閉癥[23]、精神分裂癥[24]、腫瘤[25-26]、反復(fù)自然性流產(chǎn)[27]、男性不育[28]等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)。
中國人群C677T、A1298C和A66G多態(tài)位點基因型和等位基因頻率存在顯著的地理和種族差異[29],見表1。因此,加強這3個位點的基因分型研究,對臨床疾病診斷及風(fēng)險性預(yù)測具有重要意義。
該法先用PCR擴(kuò)增包含多態(tài)位點的DNA片段,然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,酶切產(chǎn)物再通過電泳予以分離,根據(jù)電泳圖譜中酶切片段的數(shù)目和大小判斷基因型。 其中MTHFR基因C677T位點關(guān)聯(lián)堿基序列GAGYC(Y=C或T),突變型等位基因T的相應(yīng)序列GAGTC能夠被限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ識別,反之,野生型等位基因C的相應(yīng)序列GAGCC不能被HinfⅠ識別,從而可用HinfⅠ甄別該位點;MTHFR基因A1298C位點關(guān)聯(lián)堿基序列GAAGM(M=A或C),野生型等位基因A的相應(yīng)序列GAAGA能夠被限制性核酸內(nèi)切酶MboⅡ識別,反之,突變型等位基因C的相應(yīng)序列GAAGC不能被MboⅡ識別,從而可用MboⅡ鑒定該位點;MTRR基因A66G位點關(guān)聯(lián)堿基序列AATRTG(R=A或G),本來沒有合適的限制性核酸內(nèi)切酶甄別該序列,但通過錯配引物PCR將其變?yōu)镃ATRTG后,野生等位基因A的相應(yīng)序列為CATATG,能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識別,反之,突變型等位基因G的相應(yīng)序列為CATGTG,不能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識別,從而可以用NdeⅠ來鑒定該位點,這個位點采用了所謂的引物介導(dǎo)的限制性分析 PCR (PCR-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)。Nasri等[30]在研究MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點與神經(jīng)管缺陷的關(guān)系時,基因分型采用的正是PCR-RFLP法。盡管PCR-RFLP法是一種經(jīng)典的基因分型方法,操作簡單,對儀器設(shè)備要求低,但由于涉及酶切反應(yīng),酶切不完全容易導(dǎo)致基因型誤判,不過在PCR產(chǎn)物中引入內(nèi)對照酶切位點可以克服這一缺點[31]。此外,目前針對3個位點的檢測需要使用3種不同的內(nèi)切酶,難以在同一反應(yīng)體系進(jìn)行3個位點的酶切反應(yīng),若能實現(xiàn)3個位點的同管酶切檢測,必將大幅提高檢測效率。
表1 中國不同地區(qū)葉酸代謝基因主要多態(tài)位點突變等位基因及基因型頻率
Table1Mutant alleles and genotypes frequencies of major polymorphisms of folate metabolism genes in different regions of China
多態(tài)位點(突變等位基因在后)地區(qū)突變純合子基因型頻率/%突變等位基因頻率/%MTHFR基因 C677T南方7(5-8)25(23-27)中部19(16-21)41(36-45)北方28(25-31)53(51-55)MTHFR基因 A1298C南方7(5-9)28(24-31)中部4(3-4)18(17-19)北方3(2-3)17(16-19)MTRR基因A66G南方8(6-10)29(28-31)中部6(6-7)25(23-27)北方6(5-6)24(23-25)
該法又叫等位基因特異性PCR(allele specific PCR,AS-PCR),它使用針對每個位點的2種等位基因特異性引物即野生型引物PW和突變型引物PM配合常規(guī)引物進(jìn)行PCR,通過電泳檢測PCR產(chǎn)物是否出現(xiàn)PW、PM特異的目的條帶來分辨基因型[32-33]。Lajin B等[34]使用該技術(shù)成功地建立了一種同管檢測MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點3個位點的方法,并檢測了126例樣本。該方法只需PCR反應(yīng)和常規(guī)的電泳就可檢測樣本基因型,簡便、快速、成本低,但影響特異性擴(kuò)增的因素較多,PCR條件優(yōu)化不當(dāng)時容易造成基因分型錯誤。
Sanger測序(雙脫氧鏈終止法)是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn),但需要昂貴的測序儀器和專業(yè)操作人員。Guo QN等[35]在一項研究中檢測了212名個體MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型,它們均由專業(yè)測序公司采用Sanger測序法完成。
焦磷酸測序(Pyrosequencing)是可與Sanger測序媲美的另一種測序技術(shù)。其原理是:引物與模板DNA退火后,在4種酶的協(xié)同作用下,將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來,通過檢測熒光的釋放和強度達(dá)到實時測定DNA序列的目的。該方法不僅需要昂貴的焦磷酸測序儀,而且測序反應(yīng)體系中每種成分和參數(shù)的優(yōu)化都比較麻煩。Roberto M等[36]在研究參與氟嘧啶代謝和5-氟尿嘧啶(5-FU)降解的基因的多態(tài)性時,使用該法檢測了142例胃腸道腫瘤患者的MTHFR基因C677T位點、A1298C位點的基因型。
該法是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測的一種方法。在進(jìn)行SNP分型時,PCR反應(yīng)體系里除了引物外,還有探針,最常見的為Taqman探針,每個多態(tài)位點的2個等位基因各有其標(biāo)記不同顏色熒光基團(tuán)的特異性探針,未發(fā)生PCR擴(kuò)增時,探針上一側(cè)的熒光會被探針上另一側(cè)的淬滅基團(tuán)吸收,反應(yīng)體系無法檢測到熒光,一旦發(fā)生PCR擴(kuò)增,探針上的淬滅基團(tuán)會被水解,熒光基團(tuán)發(fā)出熒光隨即被檢測,最后根據(jù)檢測到的累積熒光就可判斷樣品的基因型。墨西哥學(xué)者在研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度與相關(guān)單核苷酸多態(tài)性之間的潛在聯(lián)系時,就采用基于Taqman探針的實時熒光PCR檢測了MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型[37]。王蘇梅等[ 38]使用該法檢測了100例樣本,與PCR-RFLP法比較,符合率96%。該法操作簡單、快速,但探針成本較高,且反應(yīng)體系中引物、探針的濃度乃至DNA聚合酶的用量均需優(yōu)化,給實驗增加了一定的難度。
該法在PCR反應(yīng)體系中加入一種飽和熒光染料,該熒光染料能結(jié)合到雙鏈的DNA分子上,在PCR反應(yīng)結(jié)束后,不斷升溫,使PCR產(chǎn)物上的熒光染料不斷脫落導(dǎo)致熒光信號下降,從而繪制出相應(yīng)的熔解曲線,并根據(jù)熔解曲線的變化判斷樣本的基因型,因為不同基因型樣本PCR產(chǎn)物的堿基序列存在差異,解鏈行為不同導(dǎo)致熔解曲線存在差異。潘登等[39]使用該法檢測了96例樣本MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型,分型結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。李玲使用該法檢測了1 000份樣品,其中只有2例與測序結(jié)果不符,準(zhǔn)確率99.8%[40]。HRM法操作簡便、快速,不需要探針,但對儀器溫度的均一性要求非常高,反應(yīng)條件極為苛刻,必須反復(fù)摸索。
該方法是先通過PCR獲得靶DNA分子,然后將DNA分子進(jìn)行變性和復(fù)性,雜合子樣品在復(fù)性的過程中會形成同源雙鏈和異源雙鏈,在部分變性溫度條件下,異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性,在色譜柱中的保留時間少于同源雙鏈,故先被洗脫下來,出現(xiàn)2個峰或多個峰。李才明等[41]用此法檢測了334例南方漢族人的MTHFR基因C677T位點,CT基因型顯示為2個峰,而CC和TT基因型標(biāo)本在單獨進(jìn)樣時僅出現(xiàn)單峰,而將CC和TT基因型的PCR產(chǎn)物混合后再進(jìn)樣,可出現(xiàn)與CT基因型標(biāo)本類似的雙峰,經(jīng)酶切和測序驗證,準(zhǔn)確率99%以上。DHPLC檢測高效快速,但對所用試劑和環(huán)境要求較高,否則容易產(chǎn)生誤差。
它是將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后使用引物延伸單個堿基(多態(tài)位點堿基),根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。該法分析速度快、準(zhǔn)確度高,但需要昂貴的質(zhì)譜儀,且對操作人員要求高。Suthandiram S等[42]使用Sequenom-MassARRAY平臺對372名非霍奇金淋巴瘤患者和722名對照者進(jìn)行基因分型以研究MTHFR基因 C677T和A1298C單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤的患病風(fēng)險。
該技術(shù)在芯片上固定不同基因位點的特異性探針,然后與熒光標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交,通過雜交信號來判斷基因型。Gra O等[43]采用一種名叫“Pharmagen biochip”的DNA微陣列檢測了352名健康志愿者的MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G 位點的基因型。這類方法可一次性檢測出多個SNP位點,但特異性較差,樣品的制備和標(biāo)記較為繁瑣,檢測成本高。
該方法雖然也涉及核酸的擴(kuò)增,但屬于恒溫擴(kuò)增,不需像PCR那樣設(shè)置溫度循環(huán)。它針對每個位點設(shè)立2個實時反應(yīng)體系,每個反應(yīng)體系包含一條序列一致的引物和一條等位基因特異的探針,此外,還含有單鏈結(jié)合蛋白SSB、重組酶UvsX、DNA 聚合酶、核酸外切酶Ⅲ等主要成分。當(dāng)探針與靶DNA特異性雜交結(jié)合后,能夠被核酸外切酶Ⅲ在 多態(tài)位點3′端附近的一個人為引進(jìn)的四氫呋喃位點發(fā)生切割,切割產(chǎn)生的5′端片段能充當(dāng)引物,在SSB、UvsX、DNA 聚合酶的協(xié)同作用下完成靶序列的擴(kuò)增,切下的3′端片段上的熒光基團(tuán)則能發(fā)出熒光,通過相關(guān)儀器收集累積的熒光信號就能判斷基因型。Duan S等[44]使用該法檢測了150例先天性心臟病患者的MTHFR基因A1298C位點的基因型,擴(kuò)增反應(yīng)在39 ℃下35 min內(nèi)便可完成,分型結(jié)果與直接測序完全吻合。本法操作簡便、快速,但引物的設(shè)計非常受限,引物的修飾標(biāo)記比較麻煩,只能用于部分多態(tài)位點的基因分型。
該法先利用AMRS-PCR對樣品進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物兩端分別帶有地高辛及生物素標(biāo)記,它們經(jīng)過金磁微粒層析系統(tǒng)時,與層析體系中的偶聯(lián)地高辛單抗的金磁微粒及鏈親和素結(jié)合形成復(fù)合物,在層析試紙條的檢測線處聚集大量磁粒,進(jìn)而呈現(xiàn)紅色條帶,無擴(kuò)增結(jié)果則在檢測線上無條帶呈現(xiàn)。Hui W等[45]使用該法檢測了1 721例標(biāo)本,分型結(jié)果與測序結(jié)果吻合率高達(dá)99.6%。本法操作簡單,無需大型貴重儀器,PCR結(jié)束后10 min內(nèi)可得到目視化結(jié)果,但引物標(biāo)記、金磁微粒層析系統(tǒng)成本不菲,而且也難以避免AMRS-PCR本身的弊端。
綜上所述,目前對葉酸代謝通路3個主要單核苷酸多態(tài)位點的檢測方法較多,各有其優(yōu)缺點,在各種科學(xué)研究及臨床檢測中,應(yīng)綜合考慮實驗成本、實驗周期、結(jié)果的準(zhǔn)確性及相應(yīng)的儀器、設(shè)備條件,選擇合適的分型方法。