基于線粒體自噬探討參苓白術(shù)散對COPD骨骼肌損傷細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制

周曉蕓，宋雨鴻，薛丹，張麗華，胡濤

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180)

慢性阻塞性肺部疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)生與肺部對香煙煙霧(CSE)等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。CSE刺激細(xì)胞可釋放大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化/抗氧化失衡，導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變，使線粒體中受損的蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)等含量顯著增加，線粒體能量代謝障礙[2-3]。越來越多研究[4]發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用。線粒體自噬通過選擇性的清除功能障礙的線粒體，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，維持線粒體的動態(tài)和能量代謝平衡，從而下調(diào)細(xì)胞的凋亡或壞死[5]。骨骼肌是線粒體能量代謝的重要器官，COPD的發(fā)生過程中，線粒體動態(tài)平衡受到破壞，從而引起骨骼肌功能障礙[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為COPD骨骼肌疲勞的關(guān)鍵病機(jī)是“脾虛 (痰)濕盛”。參苓白術(shù)散為培土生金的代表方，具有益氣健脾功效，臨床研究[7-9]發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散對治療COPD 呼吸疲勞有較好的臨床療效，可改善肌肉能量代謝，提高患者生活質(zhì)量，且降低急性加重次數(shù)，但其相關(guān)作用機(jī)制目前尚不清楚。本文擬采用CSE處理L6大鼠成肌細(xì)胞模擬COPD骨骼肌損傷狀態(tài)，探討在參苓白術(shù)散作用下PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對保護(hù)COPD骨骼肌細(xì)胞的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

L6大鼠成肌細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，DMEM 培養(yǎng)基(美國ThermoFisher公司)，胎牛血清(美國 Gibco 公司)，BCA 蛋白定量試劑盒(美國 Sigma 公司)，PINK1、Parkin、LC3B、P62等多克隆抗體(美國 Cell Signaling 公司)，抗兔、抗鼠IgG(美國 Cell Signaling 公司)，活性氧檢測試劑盒、JC-1 線粒體膜電位熒光探針試劑盒、ATP檢測試劑盒(均為碧云天試劑公司)。參苓白術(shù)散(蓮子肉10 g，薏苡仁10 g，砂仁10 g，桔梗10 g，白扁豆15 g，白茯苓20 g，黨參20 g，炙甘草20 g，白術(shù)20 g，山藥20 g),購自康美智慧藥房，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥中心鑒定合格，采用常規(guī)方法煎煮，濃縮后制成凍干粉，放置 -20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。酶?biāo)儀((美國 Bio-RAD 公司)，電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國 Bio-RAD 公司)，CO2恒溫培養(yǎng)孵箱(美國 Thermo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將L6大鼠成肌細(xì)胞置于 37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)孵箱中，用DMEM 培養(yǎng)基(5.5 mmol /L 葡萄糖) 培養(yǎng)，每2～3天換液 1 次，待細(xì)胞貼壁生長一段時(shí)間，光鏡下觀察其融合度在 75%～85%左右，即可進(jìn)行種板、傳代、凍存等操作。

1.2.2 香煙提取物CSE的制備[10]用市售的過濾嘴香煙(大前門牌香煙，中國上海煙草有限公司)。每次用1支香煙，三通管一頭接 50 mL 注射器上，將濾嘴插入 1 mL 移液吸頭內(nèi)，吸頭另一端連接在三通管另一頭上，形成一個(gè)驅(qū)動抽吸裝置。每次抽取 50 mL 香煙煙霧，將吸入的煙霧通入10 mL DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，形成香煙霧懸液，上下反復(fù)搖動注射器 100 次，使煙霧溶解至培養(yǎng)基內(nèi)，將剩余煙霧排出。上述過程重復(fù) 6 次，混勻后用 1 mol/L NaOH 溶液滴定至 pH 7.4 左右，經(jīng)無菌 0.22 μm微孔過濾裝置過濾后備用。

1.2.3 參苓白術(shù)散溶液配制 取參苓白術(shù)散凍干粉0.5 g(采用常規(guī)方法煎煮，濃縮后制成凍干粉)，溶于5 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻后形成 100 mg/mL的母液，超聲震蕩儀 5 min，吸取至注射器針管中，用 0.22 μm過濾器過濾后 1 h 內(nèi)使用。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 將L6大鼠成肌細(xì)胞隨機(jī)分為5個(gè)組:①control組：用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞，不作任何處理。②CSE模型組：用含有2.5%CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞的24 h后換正常DEME培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。③SLB-L組：用含有2.5%CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞，24 h后換含有2.5 mg/mL參苓白術(shù)散藥液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。④SLB-M組：用含有2.5%CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞，24 h后換含有5 mg/mL參苓白術(shù)散藥液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。⑤SLB-H組：用含有2.5%CSE的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L6大鼠成肌細(xì)胞，24 h后換含有10 mg/mL參苓白術(shù)散藥液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS 將各分組的細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞1×106個(gè)/m2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。在熒光酶標(biāo)儀上使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測各組細(xì)胞的ROS含量。

1.2.6 ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體的ATP水平 按實(shí)驗(yàn)分組分別處理后，吸除培養(yǎng)液，6孔板每孔加入200 uL裂解液裂解細(xì)胞。裂解后4 ℃ 12 000g離心5 min，取上清，冰浴上溶解待用試劑，把ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP檢測裂解液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?，按照說明配置 ATP檢測工作液。取96孔黑板，每孔加100 μL ATP檢測工作液，在檢測孔內(nèi)加上80 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，用luminometer測定RLU值。

1.2.7 JC-1染色試劑盒檢測L6大鼠成肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平 制備L6大鼠成肌細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL置于流式細(xì)胞管。按實(shí)驗(yàn)分組分別處理后，按照說明配置 JC-1 染色工作液。流式管中加入0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液及0.5 mL JC-1 工作液，充分混勻。37 ℃ 避光孵育20 min，600g4 ℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。預(yù)冷的 JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌2次，棄之，加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸后，流式細(xì)胞儀檢測及記錄，Cellquest Pro 軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測各蛋白的表達(dá)水平 按實(shí)驗(yàn)分組分別處理后，加入細(xì)胞裂解液后提取蛋白。以 BCA 法測定蛋白濃度。配置 SDS-聚丙烯酰胺凝膠。組裝電泳轉(zhuǎn)膜裝置，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜上。脫脂奶粉封閉孵育 1 h。各條帶分別孵育兔抗 PINK1 抗體、兔抗LC3B 抗體、兔抗P62抗體、鼠抗Parkin 抗體、鼠抗β-actin 抗體(稀釋比例均為1∶1 000，4 ℃ 孵育過夜)。1∶2 000比例稀釋抗兔IgG 孵育 1 h。其中需要清洗的步驟均可用 TBST 清洗 3 次。用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶，以β-actin 為內(nèi)參標(biāo)化各蛋白表達(dá)的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 參苓白術(shù)散對CSE誘導(dǎo)的L6大鼠成肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的影響

結(jié)果顯示，與control組相比，CSE模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升(P<0.05)；與CSE模型組比較，中藥組各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，其中SLB-M、SLB-H組(P<0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

1234525002000150010005000ROS*#

1. control; 2. 2.5%CSE; 3.SLB-L; 4.SLB-M; 5.SLB-H(下圖同)。 與正常組相比:*P<0.05； 與模型組相比:#P<0.05。

圖1不同濃度SLB對CSE誘導(dǎo)的L6細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的影響

Figure1Effect of different SLB concentrations on ROS level in CSE-induced L6 cells

2.2 各組細(xì)胞的線粒體ATP水平的檢測

結(jié)果顯示，與control組相比，CSE模型組線粒體膜ATP水平下降(P<0.05)，與CSE模型組比較，SLB-M組細(xì)胞ATP水平上升(P<0.05)。見圖2。

151050ATP*#12345

與正常組相比:*P<0.05； 與模型組相比:#P<0.05。

圖2不同濃度SLB對CSE誘導(dǎo)的L6細(xì)胞的線粒體ATP水平的影響

Figure2Effect of different SLB concentrations on mitochon-drial ATP levels in CSE-induced L6 cells

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化的 JC-1檢測

結(jié)果顯示，與control組相比，CSE組線粒體膜電位水平下降(P<0.05)，SLB-H組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降(P<0.05); 與 CSE模型組比較，SLB-L、SLB-M組細(xì)胞線粒體膜電位水平上升(P<0.05)。見圖3。

2.4 參苓白術(shù)散對CSE誘導(dǎo)的L6大鼠成肌細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

采用 Western blot 法檢測各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與control組比較，CSE模型組LC3B、p62、PINK1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Parkin表達(dá)水平下降(P<0.05)，各中藥組LC3B蛋白表達(dá)均升高(P<0.05); SLB-L組PINK1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05) ; 與CSE模型組比較，SLB-M、SLB-H組LC3B、Parkin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而各中藥組p62蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，SLB-H組PINK1蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。見圖4。

與正常組相比:*P<0.05； 與模型組相比:#P<0.05。

圖3不同濃度SLB對CSE誘導(dǎo)的L6細(xì)胞的線粒體膜電位的影響
Figure3Effect of different SLB concentrations on mitochondrial membrane potential in CSE-induced L6 cells

LC3Bp62Pink1Parkinβ-actin160001400052000600006600042000123453.02.01.00.02.01.51.00.50.0LC3B/β-actinParkin/β-actinP62/β-actinPink1/β-actin3.02.01.00.01.51.00.50.0123451234512345*#**#**###*##**#

與正常組相比:*P<0.05； 與模型組相比:#P<0.05。

圖4不同濃度SLB對CSE誘導(dǎo)的L6大鼠成肌細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3B、PINK1、Parkin、P62 蛋白表達(dá)

Figure4Effect of different SLB concentrations on the expression of LC3B,PINK1,Parkin and p62 in CSE-induced L6 cells

3 討論

COPD患者由于通氣功能障礙，呼吸阻力升高，耗能增加，使呼吸肌長期超負(fù)荷運(yùn)動，導(dǎo)致呼吸肌順應(yīng)性下降、肌力和耐力顯著降低[11]。呼吸肌屬于橫紋肌的范疇，從胚胎學(xué)與形態(tài)學(xué)的角度分屬于骨骼肌。研究表明，持續(xù)性的呼吸肌功能障礙會引起骨骼肌損傷，骨骼肌損傷是呼吸衰竭發(fā)生的重要原因之一[12]。香煙煙霧包含較高濃度的自由基和氧化產(chǎn)物，可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS 導(dǎo)致氧化應(yīng)激，破壞體內(nèi)的氧化平衡[13]。有研究顯示，COPD患者骨骼肌組織的氧化應(yīng)激明顯增加，且發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的增加與其活動能力和活動耐力呈負(fù)相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CSE模型L6大鼠成肌細(xì)胞內(nèi)的ROS含量增加，采用參苓白術(shù)散藥劑干預(yù)治療后，明顯降低細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，表明參苓白術(shù)散可能是通過調(diào)節(jié)COPD骨骼肌損傷狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，使細(xì)胞清除ROS的能力增加，阻斷或消除ROS對骨骼肌細(xì)胞的過氧化損傷。

線粒體膜電位的穩(wěn)定是維持線粒體ATP合成和氧化磷酸化的重要條件之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜電位是觀察細(xì)胞早期凋亡以及線粒體膜流動性和通透性功能的直接指標(biāo)[15]。線粒體膜電位下降可引起線粒體內(nèi)膜通透性增加，蓄積的Ca2+釋放入細(xì)胞質(zhì)，引起電子泄露，產(chǎn)生更多的ROS，使線粒體功能出現(xiàn)障礙，合成的ATP減少，能量代謝失衡，從而引起細(xì)胞凋亡甚至壞死[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CSE誘導(dǎo)的L6大鼠成肌細(xì)胞線粒體膜電位水平及ATP合成水平顯著下降，而參苓白術(shù)散組線粒體膜電位水平及ATP水平較CSE模型組均明顯升高，提示參苓白術(shù)散可通過調(diào)節(jié)COPD骨骼肌損傷狀態(tài)下細(xì)胞線粒體的能量代謝平衡來維持細(xì)胞氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，在細(xì)胞凋亡早期抑制線粒體膜電位的下降，改善線粒體膜的通透性，維持ATP的合成，從而清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS，降低細(xì)胞的早期凋亡。

線粒體自噬可通過調(diào)控線粒體的融合和分裂清除受損及多余線粒體、減少ROS累積，從而維持線粒體的動態(tài)和能量代謝平衡[18]。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于線粒體外膜的一種蛋白激酶，能夠作為受損線粒體的分子感受器；Parkin是由PARK2基因編碼的存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種E3泛素-蛋白連接酶活性的蛋白，主要介導(dǎo)底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[19-20]。在生理狀態(tài)下，PINK1存在于線粒體外膜并很快被蛋白水解酶降解使其維持穩(wěn)定的低水平狀態(tài)。CSE誘導(dǎo)L6大鼠成肌細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)受損線粒體外膜處于去極化，線粒體膜電位下降，負(fù)責(zé)降解 PINK1 的蛋白水解酶被抑制，PINK1 在受損線粒體外膜聚集，這一過程可誘導(dǎo)Parkin 轉(zhuǎn)位到受損線粒體，從而介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。Parkin 轉(zhuǎn)位至受損線粒體后，其 E3 泛素酶被激活，從而線粒體基質(zhì)蛋白泛素化，泛素化的自噬受體蛋白P62在去極化的線粒體基質(zhì)上積累，進(jìn)而與 LC3 結(jié)合，介導(dǎo)泛素化的底物進(jìn)入自噬體，募集受損線粒體到溶酶體上從而完成線粒體自噬[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)CSE模型L6大鼠成肌細(xì)胞內(nèi)的自噬蛋白LC3B、P62 、PINK1蛋白表達(dá)水平增高，Parkin 表達(dá)水平下降，而參苓白術(shù)散干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Parkin、LC3B表達(dá)明顯增加，p62表達(dá)顯著下降，提示參苓白術(shù)散可通過激活COPD骨骼肌損傷細(xì)胞內(nèi)PINK1 /Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑，清除受損及多余的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的動態(tài)平衡和能量代謝平衡，提高細(xì)胞清除多余ROS的能力，改善細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化失衡，從而保護(hù)骨骼肌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平證明參苓白術(shù)散可激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路，提高COPD骨骼肌細(xì)胞的線粒體自噬水平，維持體內(nèi)線粒體動態(tài)平衡，減少CSE引起的氧化損傷，提示參苓白術(shù)散對改善線粒體功能，改善COPD骨骼肌肌力和耐力狀態(tài)有重要作用，從而為中藥復(fù)方在 COPD骨骼肌損傷治療方面提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。